一、肉毒梭菌

1、生物學(xué)狀性

　　肉毒梭菌屬于厭氧性梭狀芽胞桿菌屬，具有該菌的基本特性，即厭氧性的桿狀菌，形成芽胞，芽胞比繁殖體寬，呈梭狀，新鮮培養(yǎng)基的革蘭氏染色為陽性，產(chǎn)生劇烈細(xì)菌外毒素，即肉毒毒素。

　　肉毒梭菌為多形態(tài)細(xì)菌，約為4×1μm的大桿菌，兩側(cè)平行，兩端鈍園，直桿狀或稍彎曲，芽胞為卵圓形，位于次極端，或偶有位于中央，常見很多游離芽胞。有時形成長絲狀或鏈狀，有時能見到舟形、帶把柄的檸檬形、蛇樣線裝、染色較深的球莖狀，這些屬于退化型。當(dāng)菌體開始形成芽胞時，常常伴隨著自溶現(xiàn)象，可見到陰影形。

　　肉毒梭菌具有4-8根周毛性鞭毛，運動遲緩；沒有莢膜。

　　在固體培養(yǎng)基表面上，形成不正圓形，大約3毫米左右的菌落。菌落半透明，表面呈顆粒狀，邊緣不整齊，界線不明顯，向外擴(kuò)散，呈絨毛網(wǎng)狀，常常擴(kuò)散成菌苔。在血平板上，出現(xiàn)與菌落幾乎等大或者較大的溶血環(huán)。在乳糖卵黃牛奶平板上，菌落下培養(yǎng)基為乳濁，菌落表面及周圍形成彩虹薄層，不分解乳糖；分解蛋白的菌株，菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)。

　　肉毒梭菌發(fā)育最適溫度為25-35℃，培養(yǎng)基的最適的酸鹼度為pH6.0-8.2。

　　肉毒梭菌的生化性狀很不規(guī)律，即使同性，也常見到株間的差異。（見表1）

表1 各型肉毒梭菌的生化反應(yīng)

注：+陽性反應(yīng)；-陰性反應(yīng)；（±）視菌株而異；（+）多為陽性反應(yīng)；（-）多為陰性反應(yīng)。

2、肉毒梭菌的致病性

　　肉毒梭菌的致病性在于所產(chǎn)生的神經(jīng)毒素即肉毒毒素，這些毒素能引起人和動物的肉毒中毒，根據(jù)肉毒毒素的抗原性，肉毒梭菌至今已有A、B、C（1、2）、D、E、F、G等七個型。引起人群中毒的，主要有A、B、E三型。C、D二型毒素主要是畜、禽肉毒中毒的病原。F、G型肉毒梭菌極少分離，未見G型菌引起人群的中毒報道。

3、流行病學(xué)

　　肉毒梭菌廣泛存在于自然界，引起中毒的食品有臘腸、火腿、魚及魚制品和罐頭食品等。在美國以罐頭發(fā)生中毒較多，日本以魚制品較多，在我國主要以發(fā)酵食品有關(guān)，如臭豆腐、豆瓣醬、面醬、豆豉等。其它也引起中毒的食品還有：熏制未去內(nèi)臟的魚、填餡茄子、油浸大蒜、、烤土豆、炒洋蔥、蜂蜜制品等。

　　肉毒梭菌是致死性最高的病原體之一。感染劑量極低，每個人都易感。攝食18-36小時后發(fā)病為典型病癥，但不典型的可在4小時至8天不等。癥狀為虛弱、眩暈、伴隨視覺成雙、漸進(jìn)性說話障礙、呼吸和吞咽困難。也許會出現(xiàn)腹脹和便秘。毒素最終引起麻痹，呈漸進(jìn)對稱性、自上到下

　　肉毒梭菌在自然界的分布上具有某種區(qū)域性差異，顯示出生態(tài)上的差別傾向。A、B型的分布最廣其芽胞廣泛分布于自然界，各大洲的許多國家均有檢出，；C、D型的芽胞一般多存在于動物的尸體中，或在腐尸附近的土壤中；E型菌及其芽胞存在于海洋的沉積物、水產(chǎn)品的腸道內(nèi)，E型菌及其芽胞適應(yīng)于深水的低溫，使E型菌在海洋地區(qū)的廣泛分布。但是，越來越多的調(diào)查結(jié)果表明，除G型菌之外，其它各型菌的分布都是相當(dāng)廣泛的。

二、肉毒毒素

1、生物學(xué)性狀

　　肉毒梭菌的致病性在于其產(chǎn)生的神經(jīng)麻痹毒素，即肉毒毒素，而細(xì)菌本身則是一種腐生菌。各個型的肉毒梭菌分別產(chǎn)生相應(yīng)的毒素，所以，肉毒毒素也分為A、B、C、D、E、F、G等七個型。C型包括C1、 C2二個亞型。

　　A型毒素經(jīng)60℃2分鐘加熱，差不多能被完全破壞，而B、E二型毒素要經(jīng)70℃2分鐘才能被破壞；C、D二型毒素對熱的抵抗更大些；C型毒素要經(jīng)過90℃2分鐘加熱才能完全破壞，不論如何，只要煮沸1分鐘或75℃加熱5-10分鐘，毒素都能被完全破壞

　　肉毒毒素對酸性反應(yīng)比較穩(wěn)定，對堿性反應(yīng)比較敏感。某些型的肉毒毒素在適宜條件下，毒性能被胰酶激活和加強。

2、致病性

　　肉毒毒素的毒性極強，是最強的神經(jīng)麻痹毒素之一，據(jù)稱，精制毒素1微克的毒力為200，000小白鼠（20克）致死量，也就是說，1克毒素能殺死400萬噸小白鼠，一個人的致死量大概1微克左右。

3、流行病學(xué)

　　肉毒中毒是由于誤食含有肉毒毒素的食品而引起的純粹的細(xì)菌毒素食物中毒。人的肉毒中毒發(fā)生并不多，但是發(fā)病急、病程發(fā)展快、病死率高。肉毒中毒是毒素中毒，潛伏期較短，一般為6至36小時，最長60小時。主要癥狀有：視力減弱、全身無力、伸舌和張口困難、抬頭費力、瞳孔散大、呼吸麻痹等。

　　據(jù)統(tǒng)計，1899年至1990年，在美國共有2305人中毒，經(jīng)檢測，303人感染A型毒素，92人感染B型毒，3人感染E型毒素，2人感染F型毒素，有2起中毒事件是由A、B二種毒素引起。F、G二種毒素，主要引起動物肉毒中毒，尚未深入得到研究。

　　重癥患者，如果不及時治療和抗毒素特異治療，多在2至4天死亡。肉毒梭菌生長和產(chǎn)毒的最適溫度是25至30℃，而在人的體溫條件下細(xì)菌表現(xiàn)為絲狀，幾乎不能產(chǎn)毒、芽胞也不會發(fā)芽。

　　肉毒中毒一年四季均可發(fā)生，發(fā)病主要與飲食習(xí)慣有著密切關(guān)系。歐美國家主要的中毒是由于肉類食品、罐頭食品引起；日本等沿海國家主要的中毒是由于進(jìn)食水產(chǎn)品引起；我國內(nèi)地的中毒主要是由于進(jìn)食發(fā)酵食品（如：臭豆腐、豆瓣醬、豆豉等）引起的。

三、肉毒毒素檢出及肉毒梭菌檢驗

A、肉毒毒素的檢出

　　肉毒中毒的診斷，重要的是毒素的檢出及定型；罐頭食品的細(xì)菌學(xué)檢驗，有時需要證實肉毒梭菌的存在，不過，最終還是要根據(jù)產(chǎn)毒試驗來鑒定細(xì)菌及其型別。

B、肉毒毒素檢測的主要程序

1.初步的定性試驗----小白鼠腹腔注射法

　　檢驗樣品經(jīng)適當(dāng)處理后取上清夜，用明膠磷酸緩沖液稀釋（1：5、1：10、1：100三個稀釋度）后各取0.5毫升腹腔注射小白鼠；另取上清夜100℃10分鐘加熱后注射小白鼠；另取上清夜經(jīng)胰酶處理后注射小白鼠；每個注射樣注射二只小白鼠；注射后，定時觀察小白鼠，連續(xù)觀測48小時；排除24小時后死亡的白鼠和無癥狀死亡的小白鼠；48小時后，如果除了經(jīng)熱處理后再注射樣品的小白鼠未死亡，其余小白鼠均死亡的情況，重復(fù)試驗，增加稀釋倍數(shù)，計算最底致死量。并進(jìn)行抗毒素中和試驗。

2.中和試驗

　　用無菌生理鹽水溶解凍干的抗毒素，，取A、B、E、F四種抗毒素注射于小白鼠體內(nèi)；同時取未注射抗毒素的小白鼠做對照；注射抗毒素30分鐘或1小時后，注射不同稀釋度（覆蓋10、100、1000倍最小致死量）的含毒素樣品，觀察48小時，如發(fā)現(xiàn)毒素未被中和，再取C、D型抗毒素和A-F多價抗毒素重復(fù)上述試驗；如小白鼠死亡，應(yīng)將含毒素樣品稀釋后再重復(fù)以上試驗。

3．試驗的幾個注意事項

3.1典型的肉毒中毒，小白鼠會在4至6小時內(nèi)死亡，而且98-99%的小白鼠會在12小時內(nèi)死亡，因此，試驗前24小時內(nèi)的觀察是非常重要的。

3.2 24小時后的死亡是可疑的，除非有典型的癥狀出現(xiàn)。

3.3如果小白鼠注射經(jīng)1：2或1：5倍數(shù)稀釋的樣品后死亡，但注射更高稀釋度的樣品后未死亡，這也是非�？梢傻默F(xiàn)象，一般為非特異性死亡。

3.4小白鼠要用不會抹去的顏料加以標(biāo)記。

3.5小白鼠的飼料與水必須及時添加、充分供應(yīng)。

4.結(jié)果分析

4.1食物中發(fā)現(xiàn)毒素，表明未經(jīng)充分的加熱處理，可能引起肉毒中毒。

4.2檢出肉毒梭菌，但未檢出肉毒毒素，不能證明此食物會引起肉毒中毒。

4.3肉毒中毒的診斷必須以檢出食物中的肉毒毒素為準(zhǔn)。

4.4中和試驗可以為毒素定型。

C、肉毒梭菌的檢驗與分離鑒定

　　肉毒梭菌檢驗方法的重點乃是產(chǎn)毒及毒素的檢出試驗，如要證實是否有肉毒梭菌存在，只要分離、培養(yǎng)、毒素鑒定即可。

1.前增菌

　　樣品分別接種于皰肉培養(yǎng)基、TPGYT培養(yǎng)基，并分別與35、26℃培養(yǎng)7天。

2.分離

　　培養(yǎng)7天后，染色、鏡檢，觀察菌的形態(tài)是否為典型的肉毒梭菌。取1-2毫升培養(yǎng)物加等量的酒精混合（或80℃加熱10分鐘，）后在室問溫下培養(yǎng)1小時，非蛋白分解型的肉毒梭菌，因其芽胞不耐熱，不要采取熱處理的方法。

　　用接種環(huán)涂劃酒精處理液或熱處理的培養(yǎng)物于小牛肝卵黃瓊脂或厭氧卵黃瓊脂平板上，厭氧培養(yǎng)48小時，35℃。

　　典型菌落是隆起或扁平，光滑或粗糙，在卵黃培養(yǎng)基上用斜光檢驗時菌落表面通常出現(xiàn)虹暈色（iridescence）,此光區(qū)稱為“珍珠層”，C、D、E型菌通常有2-4毫米黃色沉淀區(qū)圍繞，A、B型菌通常顯示較小的沉淀區(qū)。

　　挑取10個典型菌落，分別接種于皰肉培養(yǎng)基、TPGYT培養(yǎng)基，并分別與35、26℃培養(yǎng)7天，再取培養(yǎng)物按照1.2.1、1.2.2的方法進(jìn)行肉毒毒素的檢測即可。

　　生化反應(yīng)試驗，可以為鑒定做參考，以上肉毒梭菌的培養(yǎng)、分離、鑒定試驗力求迅速，不要長時間接觸空氣，最好在厭氧條件下操作。

四、控制：

　　最根本的預(yù)防方法是加強食品衛(wèi)生管理，改進(jìn)食品的加工、調(diào)制及儲存方法，改善飲食習(xí)慣，對某些水產(chǎn)品的加工可采取事先取內(nèi)臟，并通過保持鹽水濃度為10%的腌制方法，并使水活度低于0.85或pH為4.6以下，以及對于在常溫儲存的真空包裝食品采取高壓殺菌等措施，以確保抑制肉毒梭菌產(chǎn)生毒素，杜絕肉毒中毒病例的發(fā)生。