了解和掌握雙向電泳技術(shù),并學(xué)習(xí)用它來(lái)研究與DNA 復(fù)制相關(guān)的問(wèn)題.

【實(shí)驗(yàn)原理】

    DNA 分子有線狀的,還有一些非線狀的,如復(fù)制叉和重組DNA 結(jié)構(gòu).雙向瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)就是被人們開發(fā)用以研究一些非線狀DNA 分子的.雙向瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)(2-D gel)實(shí)際上可分為兩類：中性/中性雙向凝膠電泳和中性/堿性雙向凝膠電泳技術(shù).它們的工作原理如下：

    中性/中性雙向凝膠電泳：非線狀的DNA 分子在瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)行為和線狀DNA 分子相比是不規(guī)則的.并且這種行為隨著瓊脂糖濃度或電壓增加而加劇.而這正是中性/中性雙向凝膠電泳的工作原理：在第一向中,樣品在瓊脂糖凝膠中以低瓊脂 糖濃度、低電壓的條件進(jìn)行電泳,則DNA 分子主要根據(jù)其分子量大小被分離.在第二向中,則采用高濃度瓊脂糖凝膠和較高電壓條件,DNA 分子的分離則主要根據(jù)其形狀.

    中性/堿性雙向凝膠電泳：此方法適合用來(lái)分析DNA 復(fù)制中間體.這些中間體包括各種長(zhǎng)度的新鏈部分.在第一向中與中性/中性雙向凝膠電泳一樣采用中性pH,將DNA分子按其分子量大小分開.在第二向中,采 用堿性pH,使DNA 復(fù)制中間體中新鏈部分釋放,并按其長(zhǎng)度分離,如同在普通瓊脂糖凝膠中一樣.

    雙向凝膠電泳在分析DNA 結(jié)構(gòu)方面,最大的特點(diǎn)就是簡(jiǎn)便易行.它已成功地應(yīng)用于酵母DNA 復(fù)制起點(diǎn)的定位、確定酵母復(fù)制叉阻抑點(diǎn)以及DNA 復(fù)制抑制劑機(jī)理的研究等.但雙向電泳也有一定的問(wèn)題,如得到的圖像與理論上的圖像不吻合,而且很難解釋.如果電泳條件不當(dāng),還會(huì)產(chǎn)生假象.本實(shí)驗(yàn)所介紹的 實(shí)驗(yàn)步驟適用于分析3kb～5 kb的復(fù)制型的DNA 限制性片段.

【儀器、材料與試劑】

1、瓊脂糖粉(Ⅱ型,MediumEEO,Sigma).

2、TBE 貯存液(450mmol/L Tris-硼酸鹽,10mmol/L EDTA)：1L 體積,54g Tris 堿(Fluka),27.5g 硼酸(Fluka),20mL 0.5mmol/LEDTA(pH8.0；Serva),室溫保存.

3、6×加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)(Bio-Rad)0.25%,二甲苯青FF(Bio-Rad),15%的Ficoll(400 型,pHarmacia)溶于水中,室溫保存.

4、堿性緩沖液(40mmol/L NaOH 和1mmol/L EDTA)：1L 體積,8mL 5mol/LNaOH(Fluka),2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0,Serva),需新鮮配制.

5、EB 貯存液(10mg/mL)：1g EB(Sigma),100mL 去離子水,避光容器4℃保存.

【實(shí)驗(yàn)步驟】

中性/中性雙向凝膠電泳

    第一向電泳：(低瓊脂糖濃度和低電壓)

1、用膠帶封好一個(gè)膠模,將其放在一個(gè)水平的臺(tái)面上(最好用水平儀檢測(cè)過(guò)).放入樣品梳(梳齒底部與玻璃板之間距離為2mm).

2、取適量的瓊脂糖粉末和TBE 電泳緩沖液(0.4%瓊脂糖,45mmol/Ltris-硼酸鹽和1mmol/L 的EDTA)配制凝膠,加熱時(shí)不時(shí)地輕搖玻璃瓶或錐形瓶,確保瓊脂糖全部溶解.

3、冷卻該溶液至60℃,然后倒入膠模中,讓其在室溫下靜置凝固30min～1h.完全凝固后小心移去梳子和膠帶,把膠板移至電泳槽內(nèi).

4、向電泳槽內(nèi)注入相同的TBE 緩沖液(45mmol/Ltris-硼酸鹽,1mmol/L 的EDTA)直至緩沖液剛好沒(méi)過(guò)凝膠面.

5、取一定量的DNA 樣品與6×上樣緩沖液混合,注入緩沖液中加樣孔內(nèi).蓋上電泳槽,把電源連在電極上,讓DNA 向正極泳動(dòng),電壓為1V/cm(由兩電極之間的距離測(cè)定).

6、電泳24h 后,取出膠板.用TBE 緩沖液和0.3μg/mL EB 貯存液配成的染液染色.

7、紫外光下顯色,并切下含有DNA 樣品的膠帶.

    第二向電泳：(高瓊脂糖濃度、高電壓)

8、準(zhǔn)備另外一個(gè)膠模,但不帶梳子.把模子放在一個(gè)水平臺(tái)面上(最好用水平儀檢測(cè)過(guò)),操作要在4℃冷室內(nèi)進(jìn)行.

9、制備好含有EB 的TBE 緩沖液(0.3μg/mL EB,45mmol/L Tris-硼酸鹽,lmmol/LEDTA)并冷卻至4℃.

10、按第一向電泳的方法,配制瓊脂糖凝膠,只不過(guò)瓊脂糖濃度為1.0%.

11、冷卻瓊脂糖凝膠溶液至約70℃,加入EB 至濃度為0.3μg/mL.

12、把第一向電泳中切下的樣品凝膠帶水平放置在第二個(gè)膠板的頂端,然后倒入含有1.0%瓊脂糖凝膠溶液,并使之凝固(都在4℃下進(jìn)行).

13、移去膠帶,并把膠板放到電泳槽內(nèi),向槽內(nèi)注入冷卻至4℃的含有0.3μg/mL EB的TBE 緩沖液,使緩沖液超過(guò)膠面約1mm.放置循環(huán)水泵的導(dǎo)管于電泳槽兩極間緩沖液內(nèi),使電泳液在兩極間循環(huán).

14、 蓋上電泳槽并接好電源.DNA將向正極泳動(dòng).電壓4V/cm,4℃下電泳14h,電泳結(jié)束后,將膠板從電泳槽內(nèi)取出.如果DNA樣品已被標(biāo)記(如32P) 可直接進(jìn)行放射自顯影.若樣品沒(méi)有被標(biāo)記,可采用雜交的方法.放射自顯影可在室溫下進(jìn)行,也可在-70℃下用增敏屏進(jìn)行曝光.沒(méi)有標(biāo)記的樣品可用 Southern-雜交或堿性轉(zhuǎn)移法將樣品DNA轉(zhuǎn)至尼龍膜上,用同位素標(biāo)記探針雜交而進(jìn)行檢測(cè).

中性/堿雙向電泳

    第一向電泳：中性/堿性雙向電泳的第一向同中性/中性雙向電泳的第一向電泳步驟幾乎完全相同.

    第二向電泳：(0.8%瓊脂糖,NaOH-EDTA 緩沖液,電壓1V/cm)

1、制備一個(gè)膠模不帶梳子,并把它放于4℃冷室內(nèi)的水平臺(tái)面上(最好用水平儀測(cè)過(guò)).

2、配制NaOH-EDTA 緩沖液(40mmol/L NaOH,1mmol/L EDTA)冷卻到4℃.

3、把從第一向電泳中切下的樣品帶置于堿性緩沖液中,室溫下平衡至少30min.之后將平衡好的樣品帶平行放置在膠模的一端,溫度為4℃.

4、配制瓊脂糖凝膠,濃度為0.8%.

5、將瓊脂糖溶液冷卻至60℃后,加入NaOH 和EDTA 至濃度分別為40mmol/L 和1mmol/L,將配好的膠液倒入模子中,讓樣品帶和膠在4℃下靜置凝固.

6、去掉膠模上的膠帶,把膠板放入電泳槽內(nèi).加入堿性緩沖液至超過(guò)膠面約1mm.把循環(huán)水泵導(dǎo)管置于兩極間緩沖液中,并使緩沖液在電泳槽中循環(huán).

7、蓋上電泳槽,連好電源.DNA 分子將向正極泳動(dòng)(紅色接線柱).電壓1V/cm,4℃下至少24h.

8、中性/堿性雙向電泳的樣品檢測(cè)基本相同于中性/中性雙向電泳的方法.

【注意事項(xiàng)】

1、DNA 片段的大小對(duì)雙向電泳條件的選擇是一個(gè)關(guān)鍵因素,本實(shí)驗(yàn)所用例子為3kb～5kb.如果DNA 片段超過(guò)5kb,雙向電泳的條件需要相應(yīng)地改變.

2、加樣量也是一個(gè)關(guān)鍵步驟,理想的加樣量是300ng～1000ng.

3、第一向電泳中,凝膠的長(zhǎng)度應(yīng)至少達(dá)到25cm,才能保證更好地分離.0.4%的瓊脂糖凝膠比較脆,取梳子時(shí)要格外小心.

4、TBE 濃度最初采用90mmol/L Tris-硼酸鹽和2mmol/L EDTA.但現(xiàn)在通常所用的濃度僅為其一半即可提供所需緩沖能力.

5、在整個(gè)中性/中性雙向電泳過(guò)程中,要使用同一批TBE 貯存液,以保證相同的離子強(qiáng)度和pH.

6、在雙向電泳過(guò)程中,可在樣品一端加合適的DNA 分子量標(biāo)記物,幫助分析樣品的大小和位置.在第一、第二向中,該標(biāo)記物都起重要作用,尤其是在第二向中,作用更大.