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T、B淋巴細(xì)胞分離試驗(yàn)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2013-07-12  來(lái)源:實(shí)驗(yàn)室資訊網(wǎng)
核心提示:淋巴細(xì)胞主要分T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞兩大亞群,它們具有不同的特性和功能,為此在進(jìn)行某些免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí),首先需分離出純的T淋巴細(xì)
 淋巴細(xì)胞主要分T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞兩大亞群,它們具有不同的特性和功能,為此在進(jìn)行某些免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí),首先需分離出純的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。本試驗(yàn)的原理為:淋巴細(xì)胞與用溴花二氨基異硫氫化物(簡(jiǎn)稱AET)處理的綿羊紅細(xì)胞(SRBC)混合后,其中全部T淋巴細(xì)胞均能吸附AET—SRBC,形成牢固穩(wěn)定而巨大的E—花環(huán),較正常未處理的SRBC形成的E—花環(huán)百分比為高,而且形成快速,不易脫落,重復(fù)性好。再經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離時(shí),AET—E花環(huán)易沉于管底,而未形成E—花環(huán)的T淋巴細(xì)胞,用低滲液解花環(huán)周圍的AET—SRBC,便可獲得純T淋巴細(xì)胞,而B(niǎo)淋巴細(xì)胞可直接取自分層液的界面。
材料及試劑 :
a)新鮮豚鼠血
b)兔紅細(xì)胞(RRBC)
c)溴花二氨基異硫氫化物(AET)
d)淋巴細(xì)胞分層液
e)其它Hanks液,含小牛血清的199培養(yǎng)液,無(wú)菌生理鹽水,3.5%氯化鈉溶液,離心機(jī)等。
方法:
1.AET—RRBC制備
(1).AET溶液的制備
稱取AET粉劑402毫克,溶于10毫升蒸餾水中,使成為0.143M溶液,用4NNaOH溶液調(diào)pH9.0。該溶液必須新鮮配制,不宜久存。
(2).AET處理RRBC
取洗滌好壓積的RRBC,按一份壓積AET—RRBC加入4份新鮮配制的pH9.0的AET溶液充分混勻置37℃水浴15分鐘,每隔5分鐘搖勻一次。取出加冷無(wú)菌生理鹽水至離心管 口(1—2厘米)1800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。連續(xù)洗滌3—5次,每洗一次,必須充分搖勻,以減少AET—RRBC粘附成團(tuán),并觀察有無(wú)溶血。若有溶血現(xiàn)象,則用含小牛血清的199培養(yǎng)基再洗一次,最后配成10%AET—RRBC懸液,置4℃保存,不得超過(guò)5天。
(3).1%AET—RRBC的配制:
將預(yù)先配制并保存于4℃冰箱的10%濃度的AET—RRBC,以含10%小牛血清的199培養(yǎng)液稀釋至1%。
2.從新鮮豚鼠血液分離單個(gè)核細(xì)胞,操作見(jiàn)后試驗(yàn)。
3.AET—E花環(huán)試驗(yàn):
將分離的單個(gè)核細(xì)胞(2ⅹ106/毫升)與等量1%AET—RRBC混合,置37℃水浴 15分鐘,每隔5分鐘搖勻一次,分裝數(shù)管,每管2—3毫升,低速離心(1000轉(zhuǎn)/分鐘)5分鐘后,移至4℃冰箱45分鐘。
4.T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的分離
將形成E—花環(huán)的細(xì)胞懸液,再用淋巴細(xì)胞分層液分離,吸取界面云霧狀的細(xì)胞,即為富含B淋巴細(xì)胞群。沉淀于管底的E—花環(huán),用Hanks液洗一次后,加雙蒸水3毫升處理3分鐘,低滲裂解E—花環(huán)周圍的RRBC,立即加3.5%氯化鈉溶液1毫升,使還原為等滲,低速離心沉淀,即得富含T淋巴細(xì)胞群。
 
 
編輯:songjiajie2010

 
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