1、 一抗從4度拿出后,為什么要進(jìn)行37度復(fù)溫?
(1)一方面,防止切片從4度直接放入PBS易脫片;
(2)另一方面,使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有用,4度和37度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同,前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。
(3)其實(shí),我更贊同后一種說(shuō)法,因?yàn)槲覈L試把肝臟或睪丸片子從4度過(guò)夜拿出后,直接用PBS洗沒(méi)發(fā)生過(guò)脫片現(xiàn)象。
2、切片染色后背景太深,如何區(qū)分特異性與非特異性著色?
全片著色是指整個(gè)切片全都染上了顏色,著色的強(qiáng)度可深可淺,總之,分不清那些組織是陽(yáng)性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有:
(1)抗體濃度過(guò)高:一抗?jié)舛冗^(guò)高是常見(jiàn)的原因之一。解決辦法是,每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試,使每一抗體個(gè)體化,找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度,既使是即用型的抗體也應(yīng)如此,不能只簡(jiǎn)單的按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。
(2)抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度較高:解決辦法是,嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程,最好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘,及時(shí)提醒,避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng),F(xiàn)在流行的二步法(Polymer)敏感性很高,要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí),而是30分鐘,因此,要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。
(3)DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng):DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配,如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng),因?yàn)樵跊](méi)有酶的情況下,過(guò)氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力,未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控,達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過(guò)當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí),這樣做似乎不現(xiàn)實(shí),但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控,避免顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
(4)組織變干:修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì),采用DAKO筆或PAP Pen在組織周?chē)?huà)圈,可以有效的避免液體流失,也能提高操作速度。
(5)切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)(大于24小時(shí)):原因上不清楚,但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù),第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色,如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4oC冰箱過(guò)夜,對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響,如果放在室溫,特別是炎熱的夏天,會(huì)出現(xiàn)背景著色,因此,不可存放時(shí)間太長(zhǎng)。
(6)一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體:注意抗體的有效期,過(guò)期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買(mǎi)的抗體時(shí)最好設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和用使用過(guò)的抗體作比較。
3、脫片產(chǎn)生的原因有哪些?
(1)多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問(wèn)題。我原先是買(mǎi)的,邁新按說(shuō)也是不錯(cuò)的,可是都脫成什么樣子了。后面補(bǔ)做第二批時(shí)用的病理科老師自己做的片子,要好一點(diǎn)。
(2)組織切的不好,切片機(jī)的問(wèn)題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻,或者切片者手法不好等。
(3)沒(méi)烤好,時(shí)間短,溫度不夠之類。
(4)操作的時(shí)候甩的太猛了,有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩,用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。
(5)修復(fù)的問(wèn)題:抗原修復(fù)的時(shí)候高壓時(shí)間過(guò)長(zhǎng)了,或者放進(jìn)100度的修復(fù)液時(shí)手法不好,咚的一聲就丟進(jìn)去了,這樣超容易脫片。此外,用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片,但是你要用到EDTA的時(shí)候也沒(méi)辦法,只有從另外的問(wèn)題上著手。
(6)一旦見(jiàn)到有組織漂起來(lái)操作就更加要謹(jǐn)慎,用PBS的時(shí)候盡量用泡的,不要沖。基本上把這些方面都注意到了,能改善的盡量改善,脫片可以減少很多。
(7)組織的問(wèn)題,我用的組織癌癥的很多,越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。
4、免疫組化中抗原修復(fù)的最佳條件是什么?(尤其是微波修復(fù))
關(guān)于抗原修復(fù),我試過(guò)的修復(fù)條件有EDTA熱修復(fù),檸檬酸鈉為緩沖液的微波修復(fù)以及高壓鍋修復(fù)。從我的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,微波修復(fù)其實(shí)很不容易掉片子的,而EDTA熱修復(fù)和高壓鍋修復(fù)是很容易掉片子的。因?yàn)榈羝又饕且驗(yàn)榧訜徇^(guò)程中產(chǎn)生的氣泡所引起,而微波修復(fù)水加熱到沸騰,沾在片子上的氣泡就會(huì)少,不會(huì)因?yàn)樾馀萆洗鹈撈。做EDTA修復(fù)時(shí),你可以將片子靠的盡量近些,或是在載玻片四周墊些棉花什么的,然后蓋上蓋玻片,這樣修復(fù)的話就能夠盡量減少載玻片上小氣泡的形成。我們用的微波修復(fù)條件為:2.94g檸檬酸三鈉溶于1000ml的水,調(diào)PH值至6.0,微波修復(fù)10分鐘。你可以試試,時(shí)間可以根據(jù)需要自己調(diào)整。對(duì)于檸檬酸修復(fù)來(lái)說(shuō),只要高壓修復(fù)時(shí)間控制在加閥冒氣后90秒,冷水下終止開(kāi)高壓鍋蓋,高壓修復(fù)和微波修復(fù)一樣不掉片子,而且一般高壓修復(fù)效果往往更好一點(diǎn);關(guān)于EDTA熱修復(fù),一般說(shuō)明書(shū)上都講的是PH值等于9,實(shí)際上我試過(guò),如果單傳用EDTA,很容易掉片子,但是用Tris-EDTA,一般就不會(huì)掉片子了,Tris-base的濃度為0.05mmol/L,高壓和微波修復(fù)都可以,PH也等于9。
5、DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻:如一片著色,一片不著色或染色淺?
著色不均勻可能與你的實(shí)驗(yàn)手法有很大關(guān)系,可能原因有:
(1)切出的片子厚度本身可能就不一樣,切出一片厚,一片薄,這樣可能造成著色深淺不一。
(2)有可能是你的顯色液底物加到片子上后沒(méi)有搖勻,造成局部底物濃度不一致,所以加完顯色液后最好將片子來(lái)回左右晃動(dòng)幾下,使片子上所有區(qū)域的底物濃度一致。
(3)如果你的片子是中間的染色深,靠近邊上的淺,那有可能是你蠟圈畫(huà)的太小,顯色液覆蓋的面積不過(guò)大而產(chǎn)生了邊緣效應(yīng)。最外側(cè)的組織片最好離顯色液外緣0.5cm。
(1)一方面,防止切片從4度直接放入PBS易脫片;
(2)另一方面,使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有用,4度和37度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同,前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。
(3)其實(shí),我更贊同后一種說(shuō)法,因?yàn)槲覈L試把肝臟或睪丸片子從4度過(guò)夜拿出后,直接用PBS洗沒(méi)發(fā)生過(guò)脫片現(xiàn)象。
2、切片染色后背景太深,如何區(qū)分特異性與非特異性著色?
全片著色是指整個(gè)切片全都染上了顏色,著色的強(qiáng)度可深可淺,總之,分不清那些組織是陽(yáng)性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有:
(1)抗體濃度過(guò)高:一抗?jié)舛冗^(guò)高是常見(jiàn)的原因之一。解決辦法是,每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試,使每一抗體個(gè)體化,找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度,既使是即用型的抗體也應(yīng)如此,不能只簡(jiǎn)單的按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。
(2)抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度較高:解決辦法是,嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程,最好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘,及時(shí)提醒,避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng),F(xiàn)在流行的二步法(Polymer)敏感性很高,要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí),而是30分鐘,因此,要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。
(3)DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng):DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配,如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng),因?yàn)樵跊](méi)有酶的情況下,過(guò)氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力,未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控,達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過(guò)當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí),這樣做似乎不現(xiàn)實(shí),但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控,避免顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
(4)組織變干:修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì),采用DAKO筆或PAP Pen在組織周?chē)?huà)圈,可以有效的避免液體流失,也能提高操作速度。
(5)切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)(大于24小時(shí)):原因上不清楚,但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù),第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色,如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4oC冰箱過(guò)夜,對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響,如果放在室溫,特別是炎熱的夏天,會(huì)出現(xiàn)背景著色,因此,不可存放時(shí)間太長(zhǎng)。
(6)一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體:注意抗體的有效期,過(guò)期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買(mǎi)的抗體時(shí)最好設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和用使用過(guò)的抗體作比較。
3、脫片產(chǎn)生的原因有哪些?
(1)多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問(wèn)題。我原先是買(mǎi)的,邁新按說(shuō)也是不錯(cuò)的,可是都脫成什么樣子了。后面補(bǔ)做第二批時(shí)用的病理科老師自己做的片子,要好一點(diǎn)。
(2)組織切的不好,切片機(jī)的問(wèn)題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻,或者切片者手法不好等。
(3)沒(méi)烤好,時(shí)間短,溫度不夠之類。
(4)操作的時(shí)候甩的太猛了,有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩,用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。
(5)修復(fù)的問(wèn)題:抗原修復(fù)的時(shí)候高壓時(shí)間過(guò)長(zhǎng)了,或者放進(jìn)100度的修復(fù)液時(shí)手法不好,咚的一聲就丟進(jìn)去了,這樣超容易脫片。此外,用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片,但是你要用到EDTA的時(shí)候也沒(méi)辦法,只有從另外的問(wèn)題上著手。
(6)一旦見(jiàn)到有組織漂起來(lái)操作就更加要謹(jǐn)慎,用PBS的時(shí)候盡量用泡的,不要沖。基本上把這些方面都注意到了,能改善的盡量改善,脫片可以減少很多。
(7)組織的問(wèn)題,我用的組織癌癥的很多,越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。
4、免疫組化中抗原修復(fù)的最佳條件是什么?(尤其是微波修復(fù))
關(guān)于抗原修復(fù),我試過(guò)的修復(fù)條件有EDTA熱修復(fù),檸檬酸鈉為緩沖液的微波修復(fù)以及高壓鍋修復(fù)。從我的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,微波修復(fù)其實(shí)很不容易掉片子的,而EDTA熱修復(fù)和高壓鍋修復(fù)是很容易掉片子的。因?yàn)榈羝又饕且驗(yàn)榧訜徇^(guò)程中產(chǎn)生的氣泡所引起,而微波修復(fù)水加熱到沸騰,沾在片子上的氣泡就會(huì)少,不會(huì)因?yàn)樾馀萆洗鹈撈。做EDTA修復(fù)時(shí),你可以將片子靠的盡量近些,或是在載玻片四周墊些棉花什么的,然后蓋上蓋玻片,這樣修復(fù)的話就能夠盡量減少載玻片上小氣泡的形成。我們用的微波修復(fù)條件為:2.94g檸檬酸三鈉溶于1000ml的水,調(diào)PH值至6.0,微波修復(fù)10分鐘。你可以試試,時(shí)間可以根據(jù)需要自己調(diào)整。對(duì)于檸檬酸修復(fù)來(lái)說(shuō),只要高壓修復(fù)時(shí)間控制在加閥冒氣后90秒,冷水下終止開(kāi)高壓鍋蓋,高壓修復(fù)和微波修復(fù)一樣不掉片子,而且一般高壓修復(fù)效果往往更好一點(diǎn);關(guān)于EDTA熱修復(fù),一般說(shuō)明書(shū)上都講的是PH值等于9,實(shí)際上我試過(guò),如果單傳用EDTA,很容易掉片子,但是用Tris-EDTA,一般就不會(huì)掉片子了,Tris-base的濃度為0.05mmol/L,高壓和微波修復(fù)都可以,PH也等于9。
5、DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻:如一片著色,一片不著色或染色淺?
著色不均勻可能與你的實(shí)驗(yàn)手法有很大關(guān)系,可能原因有:
(1)切出的片子厚度本身可能就不一樣,切出一片厚,一片薄,這樣可能造成著色深淺不一。
(2)有可能是你的顯色液底物加到片子上后沒(méi)有搖勻,造成局部底物濃度不一致,所以加完顯色液后最好將片子來(lái)回左右晃動(dòng)幾下,使片子上所有區(qū)域的底物濃度一致。
(3)如果你的片子是中間的染色深,靠近邊上的淺,那有可能是你蠟圈畫(huà)的太小,顯色液覆蓋的面積不過(guò)大而產(chǎn)生了邊緣效應(yīng)。最外側(cè)的組織片最好離顯色液外緣0.5cm。