原理:
Ø 酶譜法的基本過程是先將樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明膠)電泳分離,然后在有二價金屬離子存在的緩沖 系統(tǒng)中使樣品中的MMP-2和MMP-9恢復(fù)活性,在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠,最后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色,再脫色,在 藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶,條帶的強(qiáng)弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。
復(fù)性原理:在電泳過程中,SDS與樣品中的MMPs結(jié)合(當(dāng)然是可逆性結(jié)合),破壞其氫鍵、疏水鍵而使MMPs不能發(fā)揮其分解明膠的作用,而只有當(dāng)將膠置Trition中洗脫(最好是放在搖床上搖,30min/次,做2次或15min/次,4次。靜置于Trition中是不妥的。)時,由于SDS被Trition結(jié)合而去除,從而使MMPs恢復(fù)了活性。
試劑的配制
(1)配制10%SDS聚丙烯酰胺凝膠(含1.0mg/ml 明膠,配好后1周內(nèi)使用,明膠含量低靈敏度高)
A.分離膠的配制(注:根據(jù)你所用的電泳儀膠的大小確定配制膠的量)
10% SDS聚丙烯酰胺凝膠 10ml(包括)
ddH2O 4.5ml
30%儲備膠(0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺) 2ml
1.5mol/l Tris(PH 8.8) 2.5ml
10% SDS 100ul
10%過硫酸銨(APS) 100ul
TEMED 8ul
1%明膠(1g明膠-->100ml,37°C水浴溶解) 0.5ml
B.濃縮膠的配制
濃縮膠 6ml
ddH2O 4.5ml
30%儲備膠 0.75ml
1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml
10% SDS 60ul
10%過硫酸銨 60ul
TEMED 6ul
(3)5×Tris �甘氨酸電極緩沖液
0.125mol/l Tris-HCL,1.25mol/l 甘氨酸,0.5%SDS(PH 8.3)
(4)4 ×上樣緩沖液
0.32% Tris-HCL 6.4ml
4%SDS(PH7.2) 8ml
16%甘油 3.2 ml
溴酚藍(lán) 0.024g
ddH2O 2.4ml
(5) 洗脫液:2.5% Triton X-100,50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ,5mmol/L CaCl2<0.5549g/L>,pH7. 6 (40分鐘兩次,中間換液)
(6)漂洗液: 50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L CaCl2,pH7. 6 (20分鐘2次)
(7)孵育液:50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3(孵育42小時)
(8)染色液:0.05% Coomassic 亮藍(lán) R-250,30%甲醇,10%乙酸(染色3小時)
(9)脫色液A、B、C:甲醇濃度分別為30%、20%、10 % ,乙酸濃度分別為10 %、10 %、5% (分別30min、1h、2h脫色)
實驗步驟
1.取對數(shù)期的癌細(xì)胞在的無血清培養(yǎng)基DMEM中培養(yǎng)24h。
2.次日收集上清液,將上清液移入離心管中 2000rpm 離心10min,-70℃儲存?zhèn)溆谩?/div>
3.根據(jù)細(xì)胞計數(shù)調(diào)整各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的蛋白濃度(或者測定蛋白濃度調(diào)整使所上蛋白總量一致)。與5×上樣緩沖液混合,13ul樣本+4ul上樣緩沖液。(不要用槍用力吹打,防止出現(xiàn)過多氣泡)
4.配制分離膠和濃縮膠,16ul/孔上樣(根據(jù)表達(dá)強(qiáng)度和蛋白濃度確定上樣量),4℃進(jìn)行SDS-PAGE 電泳100v約1.5小時(電泳時在周圍敷上冰,有利于使條帶跑直)。
5.電泳結(jié)束后,將凝膠置于洗脫液(2.5% Triton X-100,50mmol/L Tris -HCl ,5mmol/L CaCl2,pH7. 6) 中振蕩洗脫2次,每次40分鐘,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脫液) 漂洗2次,每次20分鐘,接著,將凝膠置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃ 孵育42h。
6.孵育結(jié)束后經(jīng)染色液(0.05% Coomassic 亮藍(lán)、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脫色液A、B、C(甲醇濃度分別為30%、20%、10 % ,乙酸濃度分別為10 %、10 %、5%) 分別脫色0.5、1、2h后,顯示出MMP-2(72KD) 和MMP -9(92 KD)為位于藍(lán)色背景上的透亮帶,用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析讀取條帶面積,寬度和灰度值,做統(tǒng)計分析。
注意事項:
1.制備聚丙烯酰胺時應(yīng)注意排除氣泡 。
2.明膠酶譜的活性受鈣離子,鋅離子,和PH值等因素的影響,因此緩沖液 配制應(yīng)嚴(yán)格準(zhǔn)確,盡量用超純水,孵育溫度也掌握好。
3.用大梳子
4.孵育液的PH最好在7.5-7.6,復(fù)性的TRITON時間長了會有絮狀物,所以實驗時盡量使用新鮮配置的。
5.孵育的37度不要在CO2培養(yǎng)箱中,因為會改變孵育液的PH值,在普通孵箱即可。
6.明膠要4度保存,配好后1周內(nèi)使用
凝膠制備:
1.玻璃板對齊后放入夾中,垂直卡緊,加滿水檢漏。
2.配10%分離膠,APS和TEMED作用為促凝,最后灌膠前加。若板不漏水,則將水倒出,并用吸水紙洗凈后灌膠,灌至大約3/4處,上面加滿水壓平。
3.配濃縮膠,同樣地,APS和TEMED最后加,分離膠灌入約30min后觀察小燒杯中剩余分離膠是否已凝,同時仔細(xì)觀察可見玻板水和膠間有一條折線,說明膠已凝固。
4.將上面的水倒去,吸水紙洗凈,灌入濃縮膠,灌滿,注意一定不要有氣泡,然后將梳子插入,注意保持水平,約30min后凝固可用。
5.拔梳子在電泳緩沖液中拔,加樣孔用小針筒沖洗干凈再上樣,注意上樣時勿使樣品逸至鄰孔,樣品混勻時要輕,不要產(chǎn)生氣泡,否則加樣時易導(dǎo)致逸出而使結(jié)果不準(zhǔn)確。
編輯:songjiajie2010
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