DEAE-Sephadex A-50(簡(jiǎn)稱(chēng)A-50)為弱堿性陰離子交換劑,經(jīng)過(guò)NaOH處理將Cl-型轉(zhuǎn)為OH-型后,可吸附酸性蛋白。γ1球蛋白屬中性蛋白,等電點(diǎn)為pH6.85~7.5,其余均屬酸性蛋白。在溶液為pH8.0時(shí),酸性蛋白均被A-50 吸附。從而可分離純化IgG。
1. 批量吸附法
此法可在1天內(nèi)完成提取過(guò)程,純化前后樣品體積變化不大,所得IgG無(wú)變性現(xiàn)象,抗體效價(jià)亦無(wú)明顯降低。制品可達(dá)PAGE及免疫電泳純。適用于提純?nèi)、羊、兔等血清中的IgG。
【材料和試劑】
(1)DEAE-Sephadex A-50。
(2)PB緩沖液:0.01mol/L,pH6.5 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。
【操作步驟】
(1)A-50的預(yù)處理:稱(chēng)取4~6g A-50懸浮于500~1000ml蒸餾水中,1h后傾去上層細(xì)粒。然后將A-50浸泡于0.5mol/L NaOH液(60~100ml)中,攪拌后靜置30min,以蒸餾水洗至中性,再用0.1mol/L NaH2PO4同上操作過(guò)程處理,蒸餾水洗至中性。最后用0.01mol/L,pH6.5 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(PB)平衡,減壓抽干,保存?zhèn)溆谩?/div>
(2)吸附提取:取15ml血清加等量0.01mol/L,pH6.5 PB稀釋至30ml(也可不稀釋),加入1/4體積濾干的DEAE-Sephadex A-50(相當(dāng)于干重1g)混合。室溫(或4℃)浸泡1 h后過(guò)濾,收集濾液。再加入同樣體積的DEAE-Sephadex A-50重復(fù)上述處理過(guò)程共3次,亦可在血清內(nèi)加入過(guò)量DEAE-Sephadex A-50吸附處理一次。收集濾液合并,即為提純的IgG制品;蛟偻肝鋈},濃縮、凍干保存?zhèn)溆谩?/div>
2.A-50柱層析法
【材料和試劑】
(1)DEAE-Sephadex A-50。
(2)待純化標(biāo)本:雜交瘤腹水或培養(yǎng)上清,免疫血清或飽和硫酸銨粗提品。
(3)1.5×50cm 層析柱;透析袋及其他透析和層析所需的試劑和器材。
(4)PB緩沖液:0.1mol/L,pH7.4 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。
【操作步驟】
(1)A-50經(jīng)酸堿處理,平衡至中性后,浸泡于0.1mol/L,pH7.4 PB中,置4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/div>
(2)裝柱:同DE52。
(3)平衡:松開(kāi)出水口螺旋夾,以PB平衡,控制流速為15滴/min,待洗脫液與流出液之pH值達(dá)到一致時(shí),停止平衡。
(4)加樣、洗脫、收集與濃縮:基本上同DE52,以0.1mol/L PB洗脫。
用過(guò)的DEAE-Sephadex A-50可用0.5mol/L Na2HPO4洗脫回收。洗至流出液中無(wú)蛋白(OD280nm<0.04)后再用蒸餾水洗至中性,加入0.02%疊氮鈉于4℃保存?zhèn)溆谩?/div>
編輯:songjiajie2010
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