了解常規(guī)DNA序列分析技術(shù)(Sanger雙脫氧法)的原理及操作步驟。

實(shí)驗(yàn)原理：

在分子生物學(xué)研究中，DNA的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。目前用于測序的技術(shù)主要有Sanger等(1977)發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和Gilbert(1977)發(fā)明的化學(xué)降解法。兩種方法在原理上差異很大，但都是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，產(chǎn)生A，T，C，G四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測，從而獲得DNA序列。目前Sanger測序法得到了廣泛的應(yīng)用。

Sanger法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測。

 

圖9-1 Sanger雙脫氧法DNA測序原理

自動(dòng)化測序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流。美國PE ABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA測序儀，其中310型是社會上提供DNA測序服務(wù)的生物技術(shù)公司中使用最多的一種型號。本實(shí)驗(yàn)介紹的是ABI PRISM 310型DNA測序儀的測序原理和操作規(guī)程。

310型基因分析儀(即DNA測序儀)，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該公司專利的四色熒光染料標(biāo)記的ddNTP(標(biāo)記終止物法)，因此通過單引物PCR

測序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個(gè)堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產(chǎn)物可在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由于分子大小不同，在毛細(xì)管電泳中的遷移率也不同，當(dāng)其通過毛細(xì)管讀數(shù)窗口段時(shí)，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機(jī)檢測器就可對熒光分子逐個(gè)進(jìn)行檢測，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機(jī)上同步成像，分析軟件可自動(dòng)將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達(dá)到DNA測序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。它是一臺能自動(dòng)灌膠、自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)數(shù)據(jù)收集分析等全自動(dòng)電腦控制的測定DNA 片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4)。這些凝膠顆�？讖骄�一，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細(xì)管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機(jī)和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運(yùn)行等軟件。它使用最新的CCD攝影機(jī)檢測器，使DNA測序縮短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。

由于該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進(jìn)行DNA測序、雜合子分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、微衛(wèi)星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進(jìn)行常規(guī)DNA測序外，還可進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫(yī)學(xué)上的親子和個(gè)體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。

實(shí)驗(yàn)材料：

1、客戶端：

測序模板：可以是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等。模板濃度應(yīng)調(diào)整在PCR反應(yīng)時(shí)取量1μl為宜。

A.含待測質(zhì)粒DNA的菌液：細(xì)菌繁殖和質(zhì)粒DNA抽提工作交給公司做。

B.或已提純的質(zhì)粒DNA：客戶自己完成質(zhì)粒DNA抽提工作。

C.或菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：將待測序的DNA 片段用PCR擴(kuò)增出來，作為提交給公司的模板。

測序引物：需根據(jù)所要測定的DNA 片段設(shè)計(jì)正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。

本實(shí)驗(yàn)中使用GAPDH PCR擴(kuò)增引物F2和R2：同實(shí)驗(yàn)3。

2、公司端：

[1].BigDye測序反應(yīng)試劑盒 主要試劑是BigDye Mix，內(nèi)含PE專利四色熒光標(biāo)記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應(yīng)緩沖液等。

[2].pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對照模板 0.2g/L，試劑盒配套試劑。

[3].M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，試劑盒配套試劑。

[4].DNA測序模板：可以是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等。模板濃度應(yīng)調(diào)整在PCR反應(yīng)時(shí)取量1μl為宜。本實(shí)驗(yàn)測定的質(zhì)粒DNA，濃度為0.2g/L，即200ng/μl。

[5].引物：需根據(jù)所要測定的DNA 片段設(shè)計(jì)正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。

[6].滅菌去離子水或三蒸水。

[7].0.2ml或和0.5ml的PCR管：蓋體分離，PE公司產(chǎn)品。

[8].3mol/L 醋酸鈉(pH5.2)：稱取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸餾水中，冰醋酸調(diào)pH至5.2，定容至100ml，高壓滅菌后分裝。

[9].70%乙醇和無水乙醇。

[10].NaAc/乙醇混合液：取37.5ml無水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混勻，室溫可保存1年。

[11].POP 6測序膠：ABI產(chǎn)品

[12].模板抑制試劑(TSR)：ABI產(chǎn)品

[13].10×電泳緩沖液：ABI產(chǎn)品

[14].ABI PRISM 310型全自動(dòng)DNA測序儀

[15].2400型或9600型PCR儀

[16].臺式冷凍高速離心機(jī)

[17].臺式高速離心機(jī)或袖珍離心機(jī)

操作步驟：

1、PCR測序反應(yīng)

[1].取0.2ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：

總反應(yīng)體積5μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。

[2].將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。98℃變性2min后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96 10s℃，50 5s℃，604min℃，25個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4℃保溫。

2、 醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物

[1].將混合物離心，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中。

[2].加入25μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于4℃離心30 min，小心棄上清。

[3].加70%(V/V)的乙醇50μl洗滌沉淀2次。12 000r/min于4℃離心5min，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。

3、電泳前測序PCR產(chǎn)物的處理。

[1].加入12μl的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。

[2].將溶液轉(zhuǎn)移至蓋體分離的0.2ml PCR管中，稍離心。

[3].在PCR儀上進(jìn)行熱變性(95 2min)℃，冰中驟冷，待上機(jī)。

4、上機(jī)操作

[1].按儀器操作說明書安裝毛細(xì)管，進(jìn)行毛細(xì)管位置的校正，人工手動(dòng)灌膠和建立運(yùn)行的測序順序文件。

[2].儀器將自動(dòng)灌膠至毛細(xì)管，1.2kV預(yù)電泳5min，按編程次序自動(dòng)進(jìn)樣，再預(yù)電泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下電泳2h。

[3].

電泳結(jié)束后儀器會自動(dòng)清洗，灌膠，進(jìn)下一樣品，預(yù)電泳和電泳。每一個(gè)樣品電泳總時(shí)間為2.5h。

[4].

電泳結(jié)束后儀器自動(dòng)分析或打印出彩色測序圖譜。

5、序列分析：

儀器將自動(dòng)進(jìn)行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進(jìn)行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標(biāo)出差異堿基處，提高工作效率。

6、測序完畢按儀器操作規(guī)程進(jìn)行儀器清洗與保養(yǎng)。

[1].

測序反應(yīng)精確度計(jì)算公式：100%－差異堿基數(shù)(不包括N數(shù))/650×100%

[2].

差異堿基即測定的DNA序列與已知標(biāo)準(zhǔn)DNA序列比較不同的堿基，N為儀器不能辨讀的堿基。

7、向客戶提供報(bào)告

測序報(bào)告通常為一份大約650bp的彩色圖譜和一份大約800bp的序列。

注意事項(xiàng)：

[1].ABI PRISM 310基因分析儀是高檔精密儀器，需專人操作、管理和維護(hù)。

[2].本實(shí)驗(yàn)測序PCR反應(yīng)的總體積是5μl，而且未加礦物油覆蓋，所以PCR管蓋的密封性很重要，除加完試劑后蓋緊PCR管蓋外，最好選用PE公司的PCR管。如PCR結(jié)束后PCR液小于4～4.5μl，則此PCR反應(yīng)可能失敗，不必進(jìn)行純化和上樣。

[3].作為測序用戶來說，只需提供純化好的DNA樣品和引物，一個(gè)測序PCR反應(yīng)使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR測序所需模板的量較少，一般PCR產(chǎn)物需30～90ng，單鏈DNA需50～100ng，雙鏈DNA需200～500ng，DNA的純度一般是A260nm/A280nm為1.6～2.0，最好用去離子水或三蒸水溶解DNA，不用TE緩沖液溶解。引物用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/μl較好。

[4].本實(shí)驗(yàn)使用的測序試劑盒是BigDye熒光標(biāo)記終止底物循環(huán)測序試劑盒，一般可測DNA長度為650bp左右。

[5].本儀器DNA測序精確度為(98.5±0.5) %，儀器不能辨讀的堿基N＜2%，所需測定的長度超過了650bp，則需設(shè)計(jì)另外的引物。

[6].為保證測序更為準(zhǔn)確，可設(shè)計(jì)反向引物對同一模板進(jìn)行測序，相互印證。

[7].對于N堿基可進(jìn)行人工核對，有時(shí)可以辨讀出來。

[8].為提高測序的精確度，根據(jù)星號提示位置，可人工分析該處彩色圖譜，對該處堿基作進(jìn)一步核對。

附：小鼠GAPDH mRNA 全長1002bp