慢病毒包裝技術(shù)專題

Q:什么是慢病毒 ?

A: 慢病毒載體 (Lenti vector)是用于感染細(xì)胞以實現(xiàn)穩(wěn)定導(dǎo)入基因或siRNA的病毒載體系統(tǒng)，其感染效率可以達(dá)到100%。慢病毒和細(xì)胞結(jié)合后通過包裝蛋白將含有目的基因或者干擾序列釋放到細(xì)胞內(nèi)。慢病毒RNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄為DNA。DNA整合前復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核并整合到靶細(xì)胞的染色體DNA。由于靶基因或基因干擾序列整合到染色體上并且伴隨著細(xì)胞分裂時DNA的復(fù)制一起復(fù)制，基因的導(dǎo)入能夠獲得穩(wěn)定的表達(dá)。慢病毒的顯著優(yōu)勢在于其可以整合到非分裂細(xì)胞，而其他載體(如非病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體)不具備整合到靶細(xì)胞染色體的特性，或者只能整合到分裂細(xì)胞的染色體(如常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄病毒)。目前我們使用的慢病毒載體是基于HIV-1改造而來，該載體使用最為廣泛，經(jīng)過科學(xué)家的多次改造在包裝滴度和使用安全性等方面都非常理想。在實際的使用中我們可以用來表達(dá)目的基因或目的基因加上報告基因，近年來隨著RNAi研究的深入，越來越多的科學(xué)家用慢病毒載體來表達(dá)干擾序列.

Q:慢病毒用于rna i研究

A:目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達(dá)RNAi的研究中。由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的，因而使其應(yīng)用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá)siRNA的載體, 然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達(dá)的作用。在所構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體中，是由RNA聚合酶Ⅲ啟動子來指導(dǎo)RNA合成的，這是因為RNA聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會帶poly A尾。當(dāng)RNA聚合酶Ⅲ遇到連續(xù)4個或5個T時，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會停止，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’端形成1~4個U。U6和H1 RNA啟動子是兩種RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達(dá)～21ntRNA和～50ntRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem loop)。在siRNA表達(dá)載體中，構(gòu)成siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動子分別轉(zhuǎn)錄,然后兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合形成siRNA;也可由載體直接表達(dá)小發(fā)卡狀RNA(small hairpin RNA, shRNA), 載體包含位于RNA聚合酶Ⅲ啟動子和4～5T轉(zhuǎn)錄終止位點之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有1~4 個U 3 ’ 突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工成siRNA。構(gòu)建載體前通常要通過合成siRNA的方法，尋找高效的siRNA，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達(dá)載體。

Q:如何生產(chǎn)病毒?

A:載體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后收獲病毒上清，通過超濾和超速離心進(jìn)行純化和濃縮獲得高滴度和高純度的慢病毒顆粒。

Q:病毒是否可以重新凍融?

A:病毒可以凍融，但是反復(fù)多次的凍融會降低病毒的滴度。

Q:什么是病毒的滴度?

A:病毒的滴度即每升溶液中含有的病毒數(shù)量。滴度值用于評估轉(zhuǎn)導(dǎo)一定數(shù)量靶細(xì)胞所需要的病毒數(shù)量。

Q:轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)的含義?

A:轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)即能夠感染并整合到細(xì)胞內(nèi)的病毒載體基因組,

Q:MOI的含義?

A:MOI指用來轉(zhuǎn)染單個細(xì)胞的病毒數(shù)量，即含義是感染時病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值。如果MOI為1則感染每個細(xì)胞的病毒顆粒數(shù)為1。同一種類同一批次的病毒感染不同種類的細(xì)胞，其MOI值不盡相同，需要進(jìn)行梯度實驗測算;另外不同的滴度檢測方法也會導(dǎo)致MOI很大的差異。

Q:可以獲得的病毒可以達(dá)到多少滴度?

A:常規(guī)生產(chǎn)的病毒的滴度在2 x 10E8TU/ml之間。

Q:如何使用慢病毒感染細(xì)胞?

A:使用慢病毒感染細(xì)胞的操作流程取決于細(xì)胞種類，因此首先要了解細(xì)胞的來源和背景，我們將在發(fā)貨時將通用操作流程發(fā)送客戶。通常來講首先要根據(jù)準(zhǔn)確的MOI和需要感染的細(xì)胞量計算所需要的病毒量，然后將所需病毒也加入培養(yǎng)體系后4小時左右即可換成完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。

Q:如何確定慢病毒感染靶細(xì)胞的感染效率?

A:慢病毒感染靶細(xì)胞的感染效率可以通過Real-time PCR檢測靶細(xì)胞中的慢病毒載體拷貝數(shù)來測算。另外如果構(gòu)建的慢病毒載體帶有標(biāo)記基因(如GFP、RFP等)，則可以通過FACS檢測陽性細(xì)胞的比例來評估感染效率。

Q:慢病毒感染靶細(xì)胞后，目的基因的表達(dá)是瞬時表達(dá)還是穩(wěn)定表達(dá)?

A:慢病毒感染靶細(xì)胞后，目的基因或者干擾序列被整合到細(xì)胞的染色體DNA;并且隨靶細(xì)胞的增殖分化，目的基因或者干擾序列也隨靶基因DNA的一起復(fù)制并遺傳到子代細(xì)胞中,所以是穩(wěn)定表達(dá)。

Q:通常生產(chǎn)一個慢病毒載體的實驗周期是多久?

A:我們將在收到您的訂單和實驗材料20個工作日左右完成病毒的生產(chǎn)和檢測，如果客戶需要委托購買或者合成目的基因(干擾序列)，會增加相應(yīng)的實驗周期。

Q:是否可以直接從慢病毒顆粒中提取慢病毒載體?

A:不可以。慢病毒載體用于轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞后生產(chǎn)病毒，包裝好的病毒顆粒只含有載體中5' and 3' LTR's的RNA。

Q:使用公司提供的病毒可以感染多少細(xì)胞?

A:可以感染的細(xì)胞量取決于您需要感染的靶細(xì)胞的易感性，原代細(xì)胞或者難感染的細(xì)胞需要較高的MOI,因此需要的病毒量也比較多。我們建議您可以通過預(yù)實驗確定目的細(xì)胞的MOI,即使用公司的GFP病毒設(shè)定不同的MOI(1、5、10、15等)分別感染目的細(xì)胞。

Q:如何知道靶細(xì)胞是否能夠被慢病毒感染?

A:根據(jù)現(xiàn)有的研究表明，慢病毒感染譜很廣，包括分裂和非分裂細(xì)胞。一方面可以通過查詢文獻(xiàn)得知是否可以被感染，另外也可以使用提供的GFP慢病毒載體對照顆粒進(jìn)行預(yù)實驗，確定細(xì)胞的易感性和MOI.

Q:在使用慢病毒時需要哪些預(yù)防措施?

A:慢病毒的操作要求在BSL2級別的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，實驗操作人員需帶上乳膠手套，按照標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)操作流程進(jìn)行。

Q:在實驗室使用慢病毒是否安全?

A:慢病毒載體包括包裝成分和載體成分：包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白;載體成分則與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。為降低兩種成分同源重組恢復(fù)成野生型病毒的可能，需盡量減少二者的同源性，如將包裝成分上5′LTR換成CMV (巨細(xì)胞病毒早期啟動子)、3′LTR換成SV40 polyA等。包裝成分通常被分開構(gòu)建到兩個質(zhì)粒上，一個質(zhì)粒表達(dá)Gag和Pol蛋白，另一個質(zhì)粒表達(dá)Env蛋白，其目的也是降低恢復(fù)成野生型病毒的可能。目前在用HIV-1載體已經(jīng)進(jìn)行的所有體內(nèi)外實驗中，未出現(xiàn)過有復(fù)制力的HIV，說明其安全性是有保證的。

Q:什么是自身失活慢病毒載體(SIN )?

A:SIN 載體的構(gòu)建是將載體3′LTR(長末端重復(fù)序列) 中的U3區(qū)增強(qiáng)子和啟動子序列刪除。U3-LTR 是前病毒DNA 兩端LTR 中U3 的模板, 在逆轉(zhuǎn)錄過程中, 3′L TR 中的缺失被傳遞到子代載體的5′L TR 中, 所形成的載體缺乏HIV-1 的增強(qiáng)子和啟動子序列, 即使在所有病毒蛋白都存在的情況下也不能轉(zhuǎn)錄RNA , 產(chǎn)生了一個滅活的前病毒, 但其中的外源啟動子仍然有活性, 能進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。這種方式主要用來消除病毒LTR 中的啟動子/增強(qiáng)子序列對病毒載體中外源啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的干擾作用，以及消除可能的由3′L TR 啟動子指導(dǎo)的下游基因組中原癌基因的激活與轉(zhuǎn)錄作用, 一定程度上提高了載體的安全性

Q:獲得慢病毒顆粒后是否可以在實驗室中進(jìn)一步增殖?

A:不可以�？茖W(xué)家考慮到了其使用的生物安全性將慢病毒載體改造成為復(fù)制缺陷型病毒載體。獲得的病毒顆粒的基因組不具有重組所需要的基因，并且載體具有3'LTR.自身失活的特性。

Q:慢病毒顆粒能保存多長時間?

A:在-80度條件下，慢病毒可以保存6個月左右而滴度沒有顯著丟失。

Q:公司生產(chǎn)的慢病毒的滴度是怎么定義的?

A:公司生產(chǎn)的慢病毒的滴度是感染293T細(xì)胞后使用FACS檢測有限稀釋的病毒感染細(xì)胞的陽性細(xì)胞比例來測算，或者使用Real-time PCR的方法檢測獲得的。