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1.2.2.1. 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液制備：接種大腸埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，35～37℃培養(yǎng)18～24小時。取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，制成每1ml含菌數(shù) 50～100cfu的菌懸液。
1.2.2.2.白色念珠菌菌液制備：接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng) 24～48小時；取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，制成每1ml含菌數(shù) 50～100cfu的菌懸液。
1.2.2.3.接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml 0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，吸至無菌試管內(nèi)，取1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4~10-6，制成每1ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。
1.2.3. 供試液的制備
1.2.3.1.無抑菌活性的供試品供試液的制備
◆稀釋劑：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液
◆液體供試品：供試品10ml置錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，混勻，作為供試液（1：10）。
◆固體、半固體、粘稠性供試品供試品：稱取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100ml，混勻后，作為供試液（1：10）。
1.2.3.2.具有抑菌活性的供試品供試液的制備
當(dāng)供試品具有抑菌活性時，須先消除抑菌活性，其方法如下：
◆ 培養(yǎng)基稀釋法：取供試液2ml，每0.2ml的供試液注一皿或每0.1ml的供試液注一皿；或取供試液1ml每0.5ml的供試液注一皿，傾注15ml的培養(yǎng)基，測定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)，混勻，凝固，培養(yǎng)。每1ml供試液所注的平皿生長的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)。計算每1ml供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計數(shù)規(guī)則報告菌數(shù)；控制菌檢查時可加大增菌液的用量。
◆離心沉淀集菌法：取一定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘（供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補至原量。
◆薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗可能用的稀釋級供試液，過濾，沖洗，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。
◆ 中和法：選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當(dāng)?shù)膶Π被郊姿幔亟饘俚乃幬镌谂囵B(yǎng)基內(nèi)加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸，洗必泰制劑加入聚山梨酸 80（3%）或卵磷脂（3%），鹵素中加入硫代硫酸鈉（0.1%）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性后測定。
1.2.4. 菌液組 測定所加的試驗菌數(shù)。采用平皿法，取試驗用的1ml菌液（約50～100cfu）分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。
1.2.5.試驗組
1.2.5.1.平皿法：取試驗可能用的稀釋級1ml供試液和50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。
1.2.5.2.培養(yǎng)基稀釋法（平皿法）：取試驗可能用的稀釋級1ml供試液分別注入N個平皿中，每個平皿再注入50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。
1.2.5.3薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗可能用的稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。至少要一張膜。
1.2.5.4. 離心沉淀集菌法：取規(guī)定量試驗可能用的稀釋級供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心 20分鐘，取下面1ml液體，并用稀釋劑洗滌管底，將洗滌液與1ml液體一起采用平皿法或薄膜過濾法計數(shù)。
1.2.6. 供試品對照組
取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)（方法和試驗組相同）。
1.2.7.稀釋劑對照組
若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時，應(yīng)增加稀釋劑對照組，用稀釋劑代替供試品，加入試驗菌，使最終濃度為每1ml 供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液制備方法和計數(shù)方法計數(shù)。
1.2.8.回收率計算
1.2.8.1.試驗組回收率計算
試驗組的菌回收率＝ 試驗組的菌回收率—供試品對照組平均菌落數(shù)×100%菌液組的平均菌落數(shù)
1.2.8.2. 稀釋劑對照組回收率計算
試驗組的菌回收率＝ 稀釋劑對照組平均菌落數(shù) ×100%菌液組的平均菌落數(shù)
計數(shù)方法驗證至少應(yīng)進(jìn)行3次獨立平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。
1.2.8.3. 結(jié)果判斷
在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）≥70%。若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）≥70%。照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗證，使試驗組菌回收率大于70%。
