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細(xì)胞傳代培養(yǎng)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

1. 細(xì)胞生長至高密度時(shí),即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中,一般稀釋比例為1:3 至1:6,依細(xì)胞
種類而異。
2. 材料:
2.1. 無菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca /Mg free, D-PBS,
GibcoBRL 21600-010)
2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062):
以10 ml 分裝于15 ml 無菌離心管中,保存于–20 oC,使用前放在37 oC 水槽回溫。
2.3. 新鮮培養(yǎng)基
2.4. 無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶
3. 步驟:
3.1. 附著型胞(adherent cell)
3.1.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。
3.1.2. 用D-PBS 洗滌細(xì)胞一至二次。
3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2),37 oC 作用數(shù)分鐘,于倒立顯微鏡下觀察,當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí),吸掉trypsin-EDTA 溶液。(若不移去trypsin-EDTA,則在trypsin-EDTA 作用后,加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin 作用,離心后再吸掉上清液。)
3.1.4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落,加入適量之新鮮培養(yǎng)基,以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊,混和均勻后,依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中,以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
3.2. 懸浮型細(xì)胞(suspension cell)
3.2.1. 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液,放入離心管中,離心1000 rpm 5 分鐘。
3.2.2. 吸掉上清液,加入適量之新鮮培養(yǎng)基,混和均勻后,依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中,以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
3.3. 融合瘤(hybridoma)
3.3.1. 有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會產(chǎn)生抗體,若是更換培養(yǎng)基,則可能會失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基,直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大,可傾斜放置,或分殖至新培養(yǎng)瓶中。

 
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