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昆蟲細胞--高MOI桿病毒感染

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

高MOI( Multiplicity Of Infection,等于用于感染的病毒數(shù)目與細胞數(shù)目的比值)感染是生產(chǎn)蛋白的最好方法。這有兩個原因。一是不用考慮DIP(Defective Interfering Particles,即只包裝入部分基因組的病毒顆粒)的形成,因為關心的是細胞或者培養(yǎng)液中的蛋白;二是高MOI感染是最便于控制、重復性好的方法,以達到高的蛋白表達水平。

低MOI感染也可用于生產(chǎn)蛋白,但是難以控制,難以達到最高的表達量。然而病毒需要量少的確是該法的一個優(yōu)點,對于大規(guī)模的生產(chǎn)這個優(yōu)點極為有利,只要它們可以可靠的復制,這因不同的重組病毒而異。

一般說來,用高MOI感染的方法就是將培養(yǎng)液中所有的細胞同時感染,每個細胞至少感染一個病毒顆粒。這個過程的幾率可以用Poisson分布來分析,簡而言之,如果你想同時把所有的細胞都感染,MOI值應該接近3。由于一旦加入病毒細胞就不再生長,因此你可以精確的控制感染時細胞的密度,這個密度大約應該大約是平臺期最大密度的一半。隨著細胞株的不同,大約在1.5~2.5×106細胞/ml之間。

重要的是培養(yǎng)液的量要滿足細胞生長的需要,否則將沒有足夠的營養(yǎng)使細胞生產(chǎn)病毒或者蛋白。另一方面,病毒也不可以太多,以免在細胞增殖到合適密度并用掉所有營養(yǎng)資源之前就被殺死。用高MOI感染的方法,這些條件比較容易優(yōu)化,只需準備密度變化在1~3×106細胞/ml之間的一系列細胞培養(yǎng)物,以固定的細胞:病毒比例去感染細胞,篩選蛋白產(chǎn)量最高時的那個密度即可。

采用這個方法需要你使用足夠量的病毒使細胞生長立即停止。病毒量可以通過進行一個小量實驗來確定,先使細胞達到上面確定的最優(yōu)密度,然后變化病毒的量確定感染率。高MOI感染的最大的缺點是需要準備大量的高滴度病毒,這個缺點在大量生產(chǎn)時尤為突出。例如,如果你的病毒不能形成高滴度的溶液,只能達到3×107pfu/ml左右,你需要加相當于細胞培養(yǎng)物20%體積的病毒。如果細胞的密度為2.5×106,體積為8升,那么為了得到密度為2×106細胞/ml的被感染細胞,需要加入2升病毒!你的細胞必須能夠生長到較高的密度--2×106細胞/ml,并且保持對數(shù)期良好狀態(tài),你必須加入相當于終體積20%的培養(yǎng)液以達到最終體積,這是實驗能夠順利進行下去的極限。

然而,如果你可以得到高滴度的病毒以滿足感染的需要,這種方法的產(chǎn)量、可重復性非常高。因此,我建議在表達一個新的蛋白時,開始最好先試用這種方法。并且用這種方法得到的蛋白的產(chǎn)量可作為衡量其它方法(低MOI感染)產(chǎn)量的標準。尤其是當你的培養(yǎng)物體積小時(小于500ml),這是最好的方法。

步驟

將你的細胞以2~8×105細胞/ml的密度分裝到搖瓶或者攪拌器中,達到搖瓶體積的20~40%,記得留出一些空間以待于將來加病毒。當培養(yǎng)物的體積小于500ml時,我更喜歡用搖瓶。在27±2℃培養(yǎng),轉(zhuǎn)速為100~130rpm。

第0天

培養(yǎng)細胞至密度達到大約1.5~2.5×106細胞/ml,即最大密度的一半。這可能需要多于1天的時間,與接種密度有關。

加入足夠的病毒,以使所有的細胞被同時感染,但是避免加入的病毒體積多于終體積20%,最好不要多于10%。加入的量取決于病毒的滴度。

如果細胞的密度為2×106細胞/ml,病毒的滴度為5×107pfu/ml,要達到MOI值為3,需要加入12%體積的病毒。

將搖瓶放回27℃搖床,培養(yǎng)24小時。

感染后第1天

計數(shù)細胞,估計細胞大小。如果是在高MOI下感染,那么所有的細胞都已經(jīng)被感染。它們與第0天比將不會在數(shù)目上增長,并且在細胞形態(tài)上顯著膨脹。此時很容易看到細胞表面變得粗糙,這是病毒正在出芽的結果。

如果發(fā)現(xiàn)細胞數(shù)目有所增多,可能是由于對病毒滴度的估計偏高,使得細胞沒有全部被病毒感染。這種現(xiàn)象在MOI值大于3時很少出現(xiàn),因為一般的桿病毒噬菌斑實驗結果通常是低估病毒的滴度。如果細胞數(shù)目的增長沒有超過25%,可能只會影響最佳收獲時間。平均每個細胞生產(chǎn)的蛋白量也會稍低。

感染后第2天

再次計數(shù)細胞,估計細胞大小。此時與第1天比細胞數(shù)目無論如何都不應該再增長。如果增長了,你的感染可能分布不均勻,很可能是病毒滴度低造成的。

此時細胞應該大大膨脹,細胞核占據(jù)了細胞的大部分空間。

此時可能是細胞或者培養(yǎng)液的時間了,這因不同的蛋白而異。大多數(shù)蛋白的產(chǎn)量在感染后48~72小時之間不會再有增長。不過這需要實驗來確定。

感染后第3天

再次計數(shù)細胞,估計細胞大小。此時所有的細胞應該已經(jīng)被徹底感染,細胞膨脹并且生長停止,否則就說明沒有足夠的病毒使細胞在達到平臺期之前停止增長。收獲培養(yǎng)物,離心分離細胞,將培養(yǎng)液避光保存于4℃,或者凍存于-70℃。

通常最好將細胞沉淀凍存。我喜歡的方法是將細胞重懸于小量(比如1/4體積)的PBS或者TBS(含有濃度為通常5倍的蛋白酶抑制劑)中,充分重懸后直接用微量移液器加入充滿液氮的干凈Dewar瓶中。滴下的重懸物遇到液氮迅速凍結形成小球,這些小球可以被分裝到50ml圓錐管中,凍存于Revco冰箱中。當需要從細胞中純化蛋白時,只需將這些小球逐個加入到3~5倍體積室溫下不斷攪拌的裂解緩沖液中,它們將很快融化,使緩沖液降至接近0℃。這些小球還可以用鑷子方便的轉(zhuǎn)移到eppendorf管中作小量實驗。

 
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