普通光學(xué)顯微鏡

普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造可分為兩大部分：一為機(jī)械裝置，一為光學(xué)系統(tǒng)，這兩部分很好的配合，才能發(fā)揮顯微鏡的作用。

顯微鏡的機(jī)械裝置包括鏡座、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、推動(dòng)器、粗動(dòng)螺旋、微動(dòng)螺旋等部件
（1）鏡座 鏡座是顯微鏡的基本支架，它由底座和鏡臂兩部分組成。在它上面連接有載物臺(tái)和鏡筒，它是用來(lái)安裝光學(xué)放大系統(tǒng)部件的基礎(chǔ)。
（2）鏡筒 鏡筒上接接目鏡，下接轉(zhuǎn)換器，形成接目鏡與接物鏡（裝在轉(zhuǎn)換器下）間的暗室。

從物鏡的后緣到鏡筒尾端的距離稱為機(jī)械筒長(zhǎng)。因?yàn)槲镧R的放大率是對(duì)一定的鏡筒長(zhǎng)度而言的。鏡筒長(zhǎng)度的變化，不僅放大倍率隨之變化，而且成像質(zhì)量也受到影響。因此，使用顯微鏡時(shí)，不能任意改變鏡筒長(zhǎng)度。國(guó)際上將顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)筒長(zhǎng)定為160mm，此數(shù)字標(biāo)在物鏡的外殼上。
（3）物鏡轉(zhuǎn)換器 物鏡轉(zhuǎn)換器上可安裝3—4個(gè)接物鏡，一般是三個(gè)接物鏡（低倍、高倍、油鏡）。Nikon顯微鏡裝有四個(gè)物鏡。轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，可以按需要將其中的任何一個(gè)接物鏡和鏡筒接通，與鏡筒上面的接目鏡構(gòu)成一個(gè)放大系統(tǒng)。
（4）載物臺(tái) 載物臺(tái)中央有一孔，為光線通路。在臺(tái)上裝有彈簧標(biāo)本夾和推動(dòng)器，其作用為固定或移動(dòng)標(biāo)本的位置，使得鏡檢對(duì)象恰好位于視野中心。
（5）推動(dòng)器 是移動(dòng)標(biāo)本的機(jī)械裝置，它是由一橫一縱兩個(gè)推進(jìn)齒軸的金屬架構(gòu)成的，好的顯微鏡在縱橫架桿上刻有刻度標(biāo)尺，構(gòu)成很精密的平面座標(biāo)系。如果我們須重復(fù)觀察已檢查標(biāo)本的某一部分，在第一次檢查時(shí)，可記下縱橫標(biāo)尺的數(shù)值，以后按數(shù)值移動(dòng)推動(dòng)器，就可以找到原來(lái)標(biāo)本的位置。
（6）粗動(dòng)螺旋 粗動(dòng)螺旋是移動(dòng)鏡筒調(diào)節(jié)接物鏡和標(biāo)本間距離的機(jī)件，老式顯微鏡粗螺旋向前扭，鏡頭下降接近標(biāo)本。新近出產(chǎn)的顯微鏡（如Nikon顯微鏡）鏡檢時(shí)，右手向前扭載物臺(tái)上升，讓標(biāo)本接近物鏡，反之則下降，標(biāo)本脫離物鏡。
（7）微動(dòng)螺旋 用粗動(dòng)螺旋只可以粗放的調(diào)節(jié)焦距，要得到最清晰的物象，需要用微動(dòng)螺旋做進(jìn)一步調(diào)節(jié)。微動(dòng)螺旋每轉(zhuǎn)一圈鏡筒移動(dòng)0.1毫米（100微米）。新近出產(chǎn)的較高檔次的顯微鏡的粗動(dòng)螺旋和微動(dòng)螺旋是共軸的。

顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)由反光鏡，聚光器，接物鏡，接目鏡等組成，光學(xué)系統(tǒng)使物體放大，形成物體放大像 。見(jiàn)圖1—2。
（1）反光鏡 較早的普通光學(xué)顯微鏡是用自然光檢視物體，在鏡座上裝有反光鏡。反光鏡是由一平面和另一凹面的鏡子組成，可以將投射在它上面的光線反射到聚光器透鏡的中央，照明標(biāo)本。不用聚光器時(shí)用凹面鏡，凹面鏡能起會(huì)聚光線的作用。用聚光器時(shí)，一般都用平面鏡。新近出產(chǎn)的較高檔次的顯微鏡鏡座上裝有光源，并有電流調(diào)節(jié)螺旋，可通過(guò)調(diào)節(jié)電流大小調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度。
（2）聚光器 聚光器在載物臺(tái)下面，它是由聚光透鏡、虹彩光圈和升降螺旋組成的。聚光器可分為明視場(chǎng)聚光器和暗視場(chǎng)聚光器。普通光學(xué)顯微鏡配置的都是明視場(chǎng)聚光器，明視場(chǎng)聚光器有阿貝聚光器、齊明聚光器和搖出聚光器。阿貝聚光器在物鏡數(shù)值孔徑高于0.6時(shí)會(huì)顯示出色差和球差。齊明聚光器對(duì)色差、球差和慧差的校正程度很高，是明視場(chǎng)鏡檢中質(zhì)量最好的聚光器，但它不適于4倍以下的物鏡。搖出聚光器能將聚光器上透鏡從光路中搖出滿足低倍物鏡（4×）大視場(chǎng)照明的需要。

聚光器安裝在載物臺(tái)下，其作用是將光源經(jīng)反光鏡反射來(lái)的光線聚焦于樣品上，以得到最強(qiáng)的照明，使物象獲得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以調(diào)節(jié)，使焦點(diǎn)落在被檢物體上，以得到最大亮度。一般聚光器的焦點(diǎn)在其上方1.25mm處，而其上升限度為載物臺(tái)平面下方0.1mm。因此，要求使用的載玻片厚度應(yīng)在0.8—1.2mm之間，否則被檢樣品不在焦點(diǎn)上，影響鏡檢效果。聚光器前透鏡組前面還裝有虹彩光圈，它可以開(kāi)大和縮小，影響著成像的分辨力和反差，若將虹彩光圈開(kāi)放過(guò)大，超過(guò)物鏡的數(shù)值孔徑時(shí)，便產(chǎn)生光斑；若收縮虹彩光圈過(guò)小，分辨力下降，反差增大。因此，在觀察時(shí)，通過(guò)虹彩光圈的調(diào)節(jié)再把視場(chǎng)光闌（帶有視場(chǎng)光闌的顯微鏡）開(kāi)啟到視場(chǎng)周緣的外切處，使不在視場(chǎng)內(nèi)的物體得不到任何光線的照明，以避免散射光的干擾。
（3）物鏡 安裝在鏡筒前端轉(zhuǎn)換器上的接物透鏡利用光線使被檢物體第一次造像，物鏡成像的質(zhì)量，對(duì)分辨力有著決定性的影響。物鏡的性能取決于物鏡的數(shù)值孔徑（numerical apeature簡(jiǎn)寫為NA），每個(gè)物鏡的數(shù)值孔徑都標(biāo)在物鏡的外殼上，數(shù)值孔徑越大，物鏡的性能越好。

物鏡的種類很多，可從不同角度來(lái)分類：

根據(jù)物鏡前透鏡與被檢物體之間的介質(zhì)不同，可分為：

①干燥系物鏡 以空氣為介質(zhì)，如常用的40×以下的物鏡，數(shù)值孔徑均小于1。

②油浸系物鏡 常以香柏油為介質(zhì)，此物鏡又叫油鏡頭，其放大率為90×—100×，數(shù)值孔值大于1。

根據(jù)物鏡放大率的高低，可分為：

①低倍物鏡 指1×—6×，NA值為0.04—0.15；

②中倍物鏡 指6×—25×，NA值為0.15— 0.40；

③高倍物鏡 指25×—63×，NA值為0.35—0.95；

④油浸物鏡 指90×—100×，NA值為1.25—1.40。

根據(jù)物鏡像差校正的程度來(lái)分類可分為：

①消色差物鏡 是最常用的物鏡，外殼上標(biāo)有“Ach”字樣，該物鏡可以除紅光和青光形成的色差。鏡檢時(shí)通常與惠更斯目鏡配合使用。

②復(fù)消色差物鏡 物鏡外殼上標(biāo)有“Apo”字樣，除能校正紅、藍(lán)、綠三色光的色差外，還能校正黃色光造成的相差，通常與補(bǔ)償目鏡配合使用。

③特種物鏡 在上述物鏡基礎(chǔ)上，為達(dá)到某些特定觀察效果而制造的物鏡。如：帶校正環(huán)物鏡，帶視場(chǎng)光闌物鏡，相差物鏡，熒光物鏡，無(wú)應(yīng)變物鏡，無(wú)罩物鏡，長(zhǎng)工作距離物鏡等。目前在研究中常用的物鏡還有：半復(fù)消色差物鏡（FL），平場(chǎng)物鏡(Plan)，平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡（Plan Apo）,超平場(chǎng)物鏡（Splan，超平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡（Splan Apo）等。
（4）目鏡 目鏡的作用是把物鏡放大了的實(shí)像再放大一次，并把物像映入觀察者的眼中。目鏡的結(jié)構(gòu)較物鏡簡(jiǎn)單，普通光學(xué)顯微鏡的目鏡通常由兩塊透鏡組成，上端的一塊透鏡稱“接目鏡”，下端的透鏡稱“場(chǎng)鏡”。上下透鏡之間或在兩個(gè)透鏡的下方，裝有由金屬制的環(huán)狀光闌或叫“視場(chǎng)光闌”，物鏡放大后的中間像就落在視場(chǎng)光闌平面處，所以其上可安置目鏡測(cè)微尺。

普通光學(xué)顯微鏡常用的目鏡為惠更斯目鏡（Huygens eyepiece），如要進(jìn)行研究用時(shí)，一般選用性能更好的目鏡，如補(bǔ)償目鏡（K）、平場(chǎng)目鏡（P）、廣視場(chǎng)目鏡（WF）。照相時(shí)選用照相目鏡（NFK）。

顯微鏡的放大是通過(guò)透鏡來(lái)完成的，單透鏡成像具有像差，影響像質(zhì)。由單透鏡組合而成的透鏡組相當(dāng)于一個(gè)凸透鏡，放大作用更好。圖1—4是顯微鏡的成像原理模式。AB為標(biāo)本

顯微鏡分辨能力的高低決定于光學(xué)系統(tǒng)的各種條件。被觀察的物體必須放大率高，而且清晰，物體放大后，能否呈現(xiàn)清晰的細(xì)微結(jié)構(gòu)，首先取決于物鏡的性能，其次為目鏡和聚光鏡的性能。
1、數(shù)值孔徑 也叫做鏡口率（或開(kāi)口率），簡(jiǎn)寫為N.A，在物鏡和聚光器上都標(biāo)有它們的數(shù)值孔徑，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光器的主要參數(shù)，也是判斷它們性能的最重要指標(biāo)。數(shù)值孔徑和顯微鏡的各種性能有密切的關(guān)系，它與顯微鏡的分辨力成正比，與焦深成反比，與鏡象亮度的平方根成正比。

數(shù)值孔徑可用下式表示：

N.A=n.sin	α
	2

式中：

n—物鏡與標(biāo)本之間的介質(zhì)析射率

α—物鏡的鏡口角

所謂鏡口角是指從物鏡光軸上的物點(diǎn)發(fā)出的光線與物鏡前透鏡有效直徑的邊緣所張的角度，見(jiàn)圖1—5。

鏡口角α總是小于180°。因?yàn)榭諝獾恼凵渎蕿?，所以干燥物鏡的數(shù)值孔徑總是小于1，一般為0.05—0.95；油浸物鏡如用香柏油（折射率為1.515）浸沒(méi)，則數(shù)值孔徑最大可接近1.5。雖然理論上數(shù)值孔徑的極限等于所用浸沒(méi)介質(zhì)的折射率，但實(shí)際上從透鏡的制造技術(shù)看，是不可能達(dá)到這一極限的。通常在實(shí)用范圍內(nèi)，高級(jí)油浸物鏡的最大數(shù)值孔徑是1.4。

幾種物質(zhì)的介質(zhì)的折射率如下：

空氣為1.0，水為1.33，玻璃為1.5，甘油為1.47，香柏油為1.52。

介質(zhì)折射率對(duì)物鏡光線通路的影響見(jiàn)圖1—6。
2、分辨力

D可用下式表示：

D=λ/2N.A.

可見(jiàn)光的波長(zhǎng)為0.4—0.7微米，平均波長(zhǎng)為0.55微米。若用數(shù)值孔為0.65的物鏡，則D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。這表示被檢物體在0.42微米以上時(shí)可被觀察到，若小于0.42微米就不能視見(jiàn)。如果使用數(shù)值孔徑為1.25的物鏡，則D=2.20微米。凡被檢物體長(zhǎng)度大于這個(gè)數(shù)值，均能視見(jiàn)。由此可見(jiàn)，D值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。根據(jù)上式，可通過(guò)：（1）減低波長(zhǎng)；（2）增大折射率；（3）加大鏡口角來(lái)提高分辨力。紫外線作光源的顯微鏡和電子顯微鏡就是利用短光波來(lái)提高分辨力以檢視較小的物體的。物鏡分辨力的高低與造象是否清楚有密切的關(guān)系。目鏡沒(méi)有這種性能。目鏡只放大物鏡所造的象。
3、放大率：

顯微鏡放大物體，首先經(jīng)過(guò)物鏡第一次放大造象，目鏡在明視距離造成第二次放大象。放大率就是最后的象和原物體兩者體積大小之比例。因此，顯微鏡的放大率（V）等于物鏡放大率（V₁）和目鏡放大率（V₂）的乘積，即：

V=V₁×V₂

比較精確的計(jì)算方法，可從下列公式求得

M=	△	×	D
	F1		F2

F₁=接物鏡焦距，F(xiàn)₂=接目鏡焦距 △=光學(xué)筒長(zhǎng)，D=明視距離（=250毫米）

△	=接物鏡的放大倍數(shù)	D	=接目鏡放大倍數(shù)	M=顯微鏡放大倍數(shù)
F1		F2

設(shè)△=160毫米 F₁=4毫米 D=250毫米 F₂=150毫米

則M=	△	×	D	=	160	×	250	=40×16.7=668倍
	F1		F2		4		15

4、焦深：

在顯微鏡下觀察一個(gè)標(biāo)本時(shí)，焦點(diǎn)對(duì)在某一象面時(shí)，物象最清晰，這象面為目的面。在視野內(nèi)除目的面外，還能在目的面的上面和下面看見(jiàn)模糊的物象，這兩個(gè)面之間的距離稱為焦深。物鏡的焦深和數(shù)值孔徑及放大率成反比：即數(shù)值孔徑和放大率愈大，焦深愈小。因此調(diào)節(jié)油鏡比調(diào)節(jié)低倍鏡要更加仔細(xì)，否則容易使物象滑過(guò)而找不到。
二、顯微鏡的使用操作及注意事項(xiàng)

顯微鏡結(jié)構(gòu)精密，使用時(shí)必須細(xì)心，要按下述操作步驟進(jìn)行。

1、顯微鏡從顯微鏡柜或鏡箱內(nèi)拿出時(shí)，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩(wěn)地將顯微鏡搬運(yùn)到實(shí)驗(yàn)桌上。

2、將顯微鏡放在自己身體的左前方，離桌子邊緣約10cm左右，右側(cè)可放記錄本或繪圖紙。

3、調(diào)節(jié)光照 不帶光源的顯微鏡，可利用燈光或自然光通過(guò)反光鏡來(lái)調(diào)節(jié)光照，但不能用直射陽(yáng)光，直射陽(yáng)光會(huì)影響物像的清晰并刺激眼睛。

將10×物鏡轉(zhuǎn)入光孔，將聚光器上的虹彩光圈打開(kāi)到最大位置，用左眼觀察目鏡中視野的亮度，轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡，使視野的光照達(dá)到最明亮最均勻?yàn)橹�。光線較強(qiáng)時(shí)，用平面反光鏡，光線較弱時(shí)，用凹面反光鏡。自帶光源的顯微鏡，可通過(guò)調(diào)節(jié)電流旋鈕來(lái)調(diào)節(jié)光照強(qiáng)弱。

4、調(diào)節(jié)光軸中心 顯微鏡在觀察時(shí)，其光學(xué)系統(tǒng)中的光源、聚光器、物鏡和目鏡的光軸及光闌的中心必須跟顯微鏡的光軸同在一直線上。帶視場(chǎng)光闌的顯微鏡，先將光闌縮小，用10×物鏡觀察，在視場(chǎng)內(nèi)可見(jiàn)到視場(chǎng)光闌圓球多邊形的輪廓像，如此像不在視場(chǎng)中央，可利用聚光器外側(cè)的兩個(gè)調(diào)整旋鈕將其調(diào)到中央，然后緩慢地將視場(chǎng)光闌打開(kāi)，能看到光束向視場(chǎng)周緣均勻展開(kāi)直至視場(chǎng)光闌的輪廓像完全與視場(chǎng)邊緣內(nèi)接，說(shuō)明光線已經(jīng)合軸。

（二）低倍鏡觀察 鏡檢任何標(biāo)本都要養(yǎng)成必須先用低倍鏡觀察的習(xí)慣。因?yàn)榈捅剁R視野較大，易于發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定檢查的位置。

將標(biāo)本片放置在載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推動(dòng)器，使被觀察的標(biāo)本處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)旋鈕，使物鏡調(diào)至接近標(biāo)本處，用目鏡觀察并同時(shí)用粗調(diào)節(jié)旋鈕慢慢升起鏡筒（或下降載物臺(tái)），直至物像出現(xiàn)，再用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕使物像清晰為止。用推動(dòng)器移動(dòng)標(biāo)本片，找到合適的目的像并將它移到視野中央進(jìn)行觀察。

（三）高倍鏡觀察 在低倍物鏡觀察的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)換高倍物鏡。較好的顯微鏡，低倍、高倍鏡頭是同焦的，在正常情況下，高倍物鏡的轉(zhuǎn)換不應(yīng)碰到載玻片或其上的蓋玻片。若使用不同型號(hào)的物鏡，在轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)要從側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后從目鏡觀察，調(diào)節(jié)光照，使亮度適中，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)旋鈕，使載物臺(tái)上升（或鏡筒下降），直至物像出現(xiàn)，再用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至物像清晰為止，找到需觀察的部位，并移至視野中央進(jìn)行觀察。

（四）油鏡觀察 油浸物鏡的工作距離（指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離）很短，一般在0.2mm以內(nèi)，再加上一般光學(xué)顯微鏡的油浸物鏡沒(méi)有“彈簧裝置”，因此使用油浸物鏡時(shí)要特別細(xì)心，避免由于“調(diào)焦”不慎而壓碎標(biāo)本片并使物鏡受損。

使用油鏡按下列步驟操作：

1、先用粗調(diào)節(jié)旋鈕將鏡筒提升（或?qū)⑤d物臺(tái)下降）約2cm，并將高倍鏡轉(zhuǎn)出。

2、在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。

3、從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺(tái)緩緩地上升，（或鏡筒下降），使油浸物鏡浸入香柏油中，使鏡頭幾乎與標(biāo)本接觸。

4、從接目鏡內(nèi)觀察，放大視場(chǎng)光闌及聚光鏡上的虹彩光圈（帶視場(chǎng)光闌油鏡開(kāi)大視場(chǎng)光闌），上調(diào)聚光器，使光線充分照明。用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺(tái)徐徐下降（或鏡筒上升），當(dāng)出現(xiàn)物像一閃后改用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至最清晰為止。如油鏡已離開(kāi)油面而仍未見(jiàn)到物象，必須再?gòu)膫?cè)面觀察，重復(fù)上述操作。

5、觀察完畢，下降載物臺(tái)，將油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許乙醚酒精混合液（乙醚2份，純酒精3份）或二甲苯，擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭2—3下即可，（注意向一個(gè)方向擦拭）。

6、將各部分還原，轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡頭不與載物臺(tái)通光孔相對(duì)，而是成八字形位置，再將鏡筒下降至最低，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直，用一個(gè)干凈手帕將接目鏡罩好，以免目鏡頭沾污灰塵。最后用柔軟紗布清潔載物臺(tái)等機(jī)械部分，然后將顯微鏡放回柜內(nèi)或鏡箱中。