第一節(jié) 概 述
DNA分子水平上的多態(tài)性檢測技術(shù)是進(jìn)行基因組研究的基礎(chǔ)。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段長度多態(tài)性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物進(jìn)化和分類的研究。RFLP是根據(jù)不同品種（個(gè)體）基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，或酶切位點(diǎn)之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，導(dǎo)致酶切片段大小發(fā)生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進(jìn)行檢測，從而可比較不同品種（個(gè)體）的DNA水平的差異（即多態(tài)性），多個(gè)探針的比較可以確立生物的進(jìn)化和分類關(guān)系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA的克隆，位于染色體的不同位點(diǎn)，從而可以作為一種分子標(biāo)記(Mark)，構(gòu)建分子圖譜。當(dāng)某個(gè)性狀（基因）與某個(gè)（些）分子標(biāo)記協(xié)同分離時(shí)，表明這個(gè)性狀（基因）與分子標(biāo)記連鎖。分子標(biāo)記與性狀之間交換值的大小，即表示目標(biāo)基因與分子標(biāo)記之間的距離，從而可將基因定位于分子圖譜上。分子標(biāo)記克隆在質(zhì)粒上，可以繁殖及保存。不同限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA后，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內(nèi)切酶與分子標(biāo)記組成不同組合進(jìn)行研究。常用的限制性內(nèi)切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標(biāo)記則有幾個(gè)甚至上千個(gè)。分子標(biāo)記越多，則所構(gòu)建的圖譜就越飽和。構(gòu)建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標(biāo)之一。
運(yùn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增尋找多態(tài)性DNA片段可作為分子標(biāo)記。這種方法即為RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA)。盡管RAPD技術(shù)誕生的時(shí)間很短, 但由于其獨(dú)特的檢測DNA多態(tài)性的方式以及快速、簡便的特點(diǎn),使這個(gè)技術(shù)已滲透于基因組研究的各個(gè)方面。該RAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上,它是利用一系列(通常數(shù)百個(gè))不同的隨機(jī)排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對(duì)所研究基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經(jīng)EB染色或放射性自顯影來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性,這些擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對(duì)于任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結(jié)合位點(diǎn).這些特異的結(jié)合位點(diǎn)在基因組某些區(qū)域內(nèi)的分布如符合PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補(bǔ)位置,且引物3'端相距在一定的長度范圍之內(nèi),就可擴(kuò)增出DNA片段.因此如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生相應(yīng)的變化,而使PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量的改變。通過對(duì)PCR產(chǎn)物檢測即可檢出基因組DNA的多態(tài)性。分析時(shí)可用的引物數(shù)很大,雖然對(duì)每一個(gè)引物而言其檢測基因組DNA多態(tài)性的區(qū)域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測區(qū)域幾乎覆蓋整個(gè)基因組。因此RAPD可以對(duì)整個(gè)基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測。另外，RAPD片段克隆后可作為RFLP的分子標(biāo)記進(jìn)行作圖分析。
本實(shí)驗(yàn)將學(xué)習(xí)RFLP的酶切,電泳和膜的制作以及RAPD技術(shù)。探針標(biāo)記及雜交檢測方法請(qǐng)另詳見分子雜交技術(shù)。
第二節(jié) RFLP技術(shù)
一、 材料
基因組DNA(大于50kb,分別來自不同的材料)。
二、設(shè)備
電泳儀及電泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比膠塊略大) 4塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙 ，eppendorf管(0.5ml)若干。
三、試劑：
1、限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切緩沖液。
2、5×TBE電泳緩沖液：配方見第一章。
3、變性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。
4、中和液：1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
5、10×SSC：配方見第九章。
6、其它試劑：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%， 0.25mol/L HCl 。
四. 操作步驟
1. 基因組DNA的酶解
(1) 大片斷DNA的提取詳見基因組DNA提取實(shí)驗(yàn),要求提取的DNA分子量大于50kb, 沒有降解。
(2) 在50μl反應(yīng)體系中,進(jìn)行酶切反應(yīng):
5μg基因組DNA
5μl 10×酶切緩沖液
20單位（U）限制酶(任意一種)
加ddH2 O, 至50μl
(3) 輕微振蕩, 離心,37℃反應(yīng)過夜。
(4) 取5μl反應(yīng)液,0.8％瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底，這時(shí)不應(yīng)有大于30kb的明顯亮帶出現(xiàn)。
[注意] 未酶切的DNA要防止發(fā)生降解, 酶切反應(yīng)一定要徹底。
2. Southern轉(zhuǎn)移
�。�1） 酶解的DNA經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳(可18V過夜)后EB染色觀察。
（2） 將凝膠塊浸沒于0.25mol/L HCl中脫嘌呤, 10分鐘。
（3） 取出膠塊, 蒸餾水漂洗, 轉(zhuǎn)至變性液變性45分鐘。經(jīng)蒸餾水漂洗后轉(zhuǎn)至中和液中和30分鐘。
�。�4） 預(yù)先將尼龍膜,濾紙浸入水中,再浸入10×SSC中,將一玻璃板架于盆中鋪一層濾紙(橋)然后將膠塊反轉(zhuǎn)放置,蓋上尼龍膜,上覆二層濾紙,再加蓋吸水紙,壓上半公斤重物, 以10×SSC鹽溶液吸印,維持18-24小時(shí)。也可用電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移。
（5） 取下尼龍膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速轉(zhuǎn)至0.2mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分鐘。
（6） 將膜夾于2層濾紙內(nèi), 80℃真空干燥2小時(shí)。
（7） 探針的制備和雜交見第九章分子雜交部分。
[注意] 1、 步驟（2）中脫嘌呤時(shí)間不能過長。
2、 除步驟（1）、（4）、（5）外, 其余均在搖床上進(jìn)行操作。
3、步驟（4）中,當(dāng)尼龍膜覆于膠上時(shí), 絕對(duì)防止膠與膜之間有氣泡發(fā)生, 加蓋濾時(shí)也不應(yīng)有氣泡發(fā)生。
4、有時(shí)用一種限制性內(nèi)切酶不能發(fā)現(xiàn)RFLP的差異，這時(shí)應(yīng)該試用另一種酶。
第三節(jié) RAPD技術(shù)
一、 材料
不同來源的DNA(50ng/ul)。
二、設(shè)備
PCR儀，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，電泳裝置。
三、試劑
1、隨機(jī)引物(10mer) (5umol/L)：購買成品。
2、Taq酶：購買成品。
3、10xPCR 緩沖液：配方見第八章。
4、MgCl2 ：25mmol/L。
5、dNTP：每種2.5mmol/L。
四、操作步驟：
1. 在25ul反應(yīng)體系中,加入
模板DNA 1ul (50ng)
隨機(jī)引物 1ul (約5pmol)
10xPCR Buffer 2.5ul
MgCl2 2ul
dNTP 2ul
Taq酶 1單位（U）
加ddH2O 至 25ul
混勻稍離心, 加一滴礦物油。
2. 在加熱至90℃以上的PCR儀中預(yù)變性94℃ 2分鐘, 然后循環(huán): 94℃ 1分鐘， 36℃ 1分鐘， 72℃ 1分鐘，共40輪循環(huán)。
3. 循環(huán)結(jié)束后, 72℃ 10分鐘，4℃保存。
4. 取PCR產(chǎn)物15ul加3ul上樣緩沖液(6x)于2% 瓊脂糖膠上電泳, 穩(wěn)壓50-100Ｖ（電壓低帶型整齊， 分辨率高）。
5. 電泳結(jié)束，觀察、拍照。
[注意] 1、電泳時(shí)一般RAPD帶有5-15條, 大小0.1-2.0kb。
2、 特異性的DNA帶可以克隆作為一個(gè)新的分子標(biāo)記應(yīng)用。
思考題
1. DNA酶切反應(yīng)不徹底會(huì)有何結(jié)果? DNA發(fā)生降解有何影響？
2. Southern轉(zhuǎn)移中脫嘌呤時(shí)間為何不能太長？
3. 隨機(jī)引物擴(kuò)增,為什么會(huì)產(chǎn)生DNA雙鏈產(chǎn)物?
