一、 建立一個標(biāo)準(zhǔn)的酶切反應(yīng)
目前大多數(shù)研究者遵循一條規(guī)則,即10個單位的內(nèi)切酶可以切割1μg不同來源和純度的DNA。通常,一個50μl的反應(yīng)體系中,1μl的酶在1X NEBuffer終濃度及相應(yīng)溫度條件下反應(yīng)1小時即可降解1μg已純化好的DNA。如果加入更多的酶,則可相應(yīng)縮短反應(yīng)時間;如果減少酶的用量,對許多酶來說,相應(yīng)延長反應(yīng)時間(不超過16小時)也可完全反應(yīng)。
二、 選擇正確的酶
不言而喻,選擇的酶在底物DNA上必須至少有一個相應(yīng)的識別位點。識別堿基數(shù)目少的酶比堿基數(shù)目多的酶更頻繁地切割底物。假設(shè)一個GC含量50%的DNA鏈,一個識別4個堿基的酶將平均在每44(256)個堿基中切割一次;而一個識別6個堿基的酶將平均在每46(4096)堿基切割一次。內(nèi)切酶的產(chǎn)物可以是粘端的(3'或5'突出端),也可以是平端的片段。粘端產(chǎn)物可以與相容的其它內(nèi)切酶產(chǎn)物連接,而所有的平端產(chǎn)物都可以互相連接。相關(guān)信息參見目錄的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。
三、 酶
內(nèi)切酶一旦拿出冰箱后應(yīng)當(dāng)立即置于冰上。酶應(yīng)當(dāng)是最后一個被加入到反應(yīng)體系中(在加入酶之前所有的其它反應(yīng)物都應(yīng)當(dāng)已經(jīng)加好并已預(yù)混合)。酶的用量視在底物上的切割頻率而定。例如,超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超過1U/μg的酶才能被完全切割。參見目錄第244和264之切割質(zhì)粒DNA和包埋法切割DNA。
四、 DNA
待切割的DNA應(yīng)當(dāng)已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污劑或過多鹽離子的污染,以免干擾酶的活性。DNA的甲基化也應(yīng)該是酶切要考慮到的因素。關(guān)于甲基化的內(nèi)容,參見第252頁至253頁之甲基化相關(guān)內(nèi)容。
五、 緩沖液
對于每一種酶NEB都提供相應(yīng)的最佳緩沖液,可保證幾乎100%的酶活性。使用時的緩沖液濃度應(yīng)為1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以實現(xiàn)最佳活性。在這種情況下,我們也相應(yīng)提供100X的BSA(10mg/ml)。不需要BSA的酶如果加了BSA也不會受太大影響。關(guān)于緩沖液更詳細(xì)的信息參見第234頁。
六、 反應(yīng)體積
內(nèi)切酶活力單位的定義是:1小時內(nèi),50μl反應(yīng)體積中,降解1μg的底物DNA所需的酶為一個活力單位。因此酶:DNA的反應(yīng)比例可以由此確定。較小的反應(yīng)體積更容易受到移液器誤差的影響。為了將甘油的濃度控制在5%以下,要注意酶的體積不要超過總體積的10%(一般酶都貯存于50%的甘油中)。
七、 混合
這是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反應(yīng)完全,必須使反應(yīng)液充分混合。我們推薦用槍反復(fù)吸取混合,或是用手指輕彈管壁混合,然后再快速離心一下即可。注意:不可振蕩!
八、 反應(yīng)溫度
大部分酶的反應(yīng)溫度為37℃;從嗜熱菌中分離出來的內(nèi)切酶則要求更高的溫度。一般為50-65℃不等。參看第244頁 Activity of thermophiles at 37℃。
九、 反應(yīng)時間
1酶活單位的定義時間為1小時。如果加入的酶較多,可以相應(yīng)地縮短反應(yīng)時間;反之,如果加入的酶量較少,也可以延長時間以使反應(yīng)達(dá)到完全。參見第241頁酶在反應(yīng)中的存活時間。
十、 終止反應(yīng)
如果不進(jìn)行下一步酶切反應(yīng),可用終止液來終止反應(yīng)。在NEB我們使用如下反應(yīng)終止液:50%的甘油,50mM EDTA(pH8.0),和0.05%溴酚藍(lán)(10μl/50μl反應(yīng)液)。如果要進(jìn)行下一步酶切反應(yīng),可用熱失活法終止反應(yīng)(65℃或85℃,20分鐘)。熱失活并不能適用于所有的酶,詳情參見第240頁熱失活表。此外,酚/氯仿抽提也可以用于終止反應(yīng)。
十一、貯存
大部分酶應(yīng)貯存于-20℃。少部分酶則須在-70℃長期保存。詳情請參見相關(guān)酶的DATA SHEET 或目錄相關(guān)部分。10X BUFFER 和100X BSA于-20℃保存。BSA不能與NEBuffer混合后保存,否則將會出現(xiàn)BSA沉淀。
十二、穩(wěn)定性
每隔1-2個月都會對所有的酶有一個活性檢測;最近的一次檢測結(jié)果將被貼在售出的每一管酶上。通過三十多年來的經(jīng)驗,我們發(fā)現(xiàn)大部分酶在推薦的保存緩沖液里在-20℃條件下十分穩(wěn)定。高于-20℃條件下穩(wěn)定性將有所降低。
十三、對照反應(yīng)
如果發(fā)現(xiàn)您的DNA底物不能被成功切開,可以進(jìn)行對照實驗以查明原因。具體方法如下:將不加內(nèi)切酶的底物DNA(待切底物)與加入了內(nèi)切酶的對照DNA(有多個已知酶切位點)同時進(jìn)行反應(yīng)。若實驗結(jié)果表明底物DNA降解,則說明DNA在純化過程中或反應(yīng)液里引入了核酸酶污染;若實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)底物DNA保持完整,而對照DNA被成功切開,則可以排除酶質(zhì)量的原因,此時可以將對照DNA和待切底物DNA混合起來再次進(jìn)行反應(yīng),以確定樣品中是否有抑制劑。如果有抑制劑存在(通常是鹽、EDTA或酚),則混合物里的對照DNA也無法被切開。