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定量PCR技術(shù)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

定量PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)有廣義概念和狹義概念。廣義概念的定量PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn),通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測,進行PCR起始模板量的定量。
??廣義概念下的定量PCR技術(shù)可以分為五種類型:
(1)外參法 終產(chǎn)物分析。所謂“外參法”是指樣本與陽性參照在兩個反應(yīng)容器內(nèi)反應(yīng)。這種類型沒有對樣本進行質(zhì)控監(jiān)測,易出現(xiàn)假陰假陽結(jié)果,沒有監(jiān)測擴增效率,定量不準(zhǔn)。
(2)內(nèi)參法 終產(chǎn)物分析。所謂“內(nèi)參法”是指樣本與陽性參照在一個反應(yīng)容器內(nèi)反應(yīng)。這種類型對樣本進行質(zhì)控監(jiān)測,排除假陰結(jié)果,但是定量不準(zhǔn)。

(3)外標(biāo)法 過程監(jiān)測。這種類型監(jiān)測擴增效率,陽性樣本定量準(zhǔn),但是無法排除假陰結(jié)果。

(4)內(nèi)參法 過程監(jiān)測。由于樣本與陽性參照在一個容器內(nèi)反應(yīng),用同樣的Taq酶和反應(yīng)參與物,存在竟?fàn)幮砸种疲鹗寄0辶繚舛雀叩姆磻?yīng)會抑制起始模板量濃度低的反應(yīng),所以定量不準(zhǔn)。

(5)外標(biāo)法 過程監(jiān)測 內(nèi)對照。這種類型監(jiān)測擴增效率,陽性樣本定量準(zhǔn),同時排除假陰結(jié)果。這種類型是應(yīng)該提倡的。PCR過程的監(jiān)測有多種檢測模式。最常用的有三種檢測模式:

(1)R Green I 檢測模式。溫度循環(huán)為94—55—72°C三步法,只有引物,無探針,熒光染料鑲嵌在雙股螺旋鏈中間。通過對特定方向的強熒光檢測獲得信號,這種試劑檢測模式易產(chǎn)生非特異信號,且本底光較大。

(2)解探針模式(Taqman)Hydrolysis Probe 。溫度循環(huán)為94—60°C二步法,不僅有引物,還有另外一個特異針對擴增模板的探針在引物對之間。在探針相鄰兩個堿基上分別結(jié)合兩個熒光染料,一個染料接受激發(fā)光得到的能量傳給了第二個染料,接受能量的第二個染料通過發(fā)射特征光子回到穩(wěn)定態(tài)。當(dāng)Taq酶在60°C延伸擴增鏈時,遇到探針,利用Taq酶5`—3`外切酶活性將探針?biāo)獬蓡蝹堿基,單個堿基之間距離較遠(yuǎn),第一個染料的能量無法傳給第二個染料,只好通過發(fā)射特征光子回到穩(wěn)定態(tài),通過對溶液中第一個染料的熒光檢測獲得信號。這種試劑檢測模式增加了檢測信號的特異性,但是由于利用了Taq酶5`—3`外切酶活性,一般試劑廠家只給Taq酶的聚合酶活性定標(biāo),沒有同時給Taq酶5`—3`外切酶活性定標(biāo),不同批號試劑之間會給定量帶來差異。另外對探針的熔點溫度(Tm)僅要求其高于60°C,這就使不同試劑盒之間的特異性參差不齊,而且無法做質(zhì)控檢測。

(3)雜交探針(Hybridization Probes)模式。溫度循環(huán)為94—55—72°C三步法,有引物,二個特異針對擴增模板相鄰的探針在引物對之間,在一個探針3`堿基上結(jié)合一個熒光染料,在另一個探針5`堿基上結(jié)合第二個熒光染料。在55°C時,兩個探針都剛好接合在模板上,第一個染料接受激發(fā)光得到的能量傳給了第二個染料,接受能量的第二個染料通過發(fā)射特征光子回到穩(wěn)定態(tài),通過對結(jié)合在擴增模板上雙探針中第二個染料的熒光檢測獲得信號。這種試劑檢測模式中熒光信號與特定雜交溫度相關(guān),探針的濃度始終保持不變,因此可以在擴增后檢測熔解曲線作為信號的特異性質(zhì)控。另外這種試劑檢測模式可以用于點突變檢測。
??狹義概念的定量PCR技術(shù)(嚴(yán)格意義的定量PCR技術(shù))是指用外標(biāo)法(熒光雜交探針保證特異性)通過監(jiān)測PCR過程(監(jiān)測擴增效率)達(dá)到精確定量起始模板數(shù)的目的,同時以內(nèi)對照有效排除假陰性結(jié)果(擴增效率為零)。在國家沒有出臺陰陽判定標(biāo)準(zhǔn)時,所用PCR系統(tǒng)靈敏度最好達(dá)到一個拷貝(一個病毒)。從理論上說,只要有一個拷貝數(shù),樣本就算陽性;一個拷貝數(shù)都沒有才算陰性。

 
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