離子交換層析技術(shù)是以離子交換纖維素或以離子交換葡聚糖凝膠為固定相，以蛋白質(zhì)等樣品為移動(dòng)相，分離和提純蛋白質(zhì)、核酸、酶、激素和多糖等的一項(xiàng)技術(shù)。
（一）原理
在纖維素與葡聚糖分子上結(jié)合有一定的離子基團(tuán)，當(dāng)結(jié)合陽(yáng)離子基團(tuán)時(shí)，可換出陰離子，則稱(chēng)為陰離子交換劑。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纖維素。在纖維素上結(jié)合了DEAE，含有帶正電荷的陽(yáng)離子纖維素—O—C6 H14N H，它的反離子為陰離子（如Cl-等），可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)陰離子進(jìn)行交換。當(dāng)結(jié)合陰離子基團(tuán)時(shí)，可置換陽(yáng)離子，稱(chēng)為陽(yáng)離子交換劑，如羧甲基（Carboxymethy， CM）纖維素。纖維素分子上帶有負(fù)電荷的陰離子（纖維素－O－CH2－COO一），其反離子為陽(yáng)離子（如Na 等）,可與帶正電荷蛋白質(zhì)陽(yáng)離子進(jìn)行交換。
溶液的pH值與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)相同時(shí)，靜電荷為0，當(dāng)溶液pH值大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，則羧基游離，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷。反之，溶液的pH值小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，則氨基電離，蛋白質(zhì)帶正電荷。溶液的pH值距蛋白質(zhì)等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，蛋白質(zhì)的電荷越多。反之則越少。血清蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷，但各種蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的程度有所差異，以白蛋白為最多，依次為 球蛋白， 球蛋白和 球蛋白。
在適當(dāng)?shù)柠}濃度下，溶液的pH值高于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)被陰離子交換劑所吸附；當(dāng)溶液的pH值低于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)被陽(yáng)離子交換劑所吸附。由于各種蛋白質(zhì)所帶的電荷不同。它們與交換劑的結(jié)合程度也不同，只要溶液pH值發(fā)生改變，就會(huì)直接影響到蛋白質(zhì)與交換劑的吸附，從而可能把不同的蛋白質(zhì)逐個(gè)分離開(kāi)來(lái)。
交換劑對(duì)膠體離子（如蛋白質(zhì)）和無(wú)機(jī)鹽離子（如NaCl）都具有交換吸附的能力，當(dāng)兩者同時(shí)存在于一個(gè)層析過(guò)程中，則產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性的交換吸附。當(dāng)Cl一的濃度大時(shí)，蛋白質(zhì)不容易被吸附，吸附后也易于被洗脫，當(dāng)Cl一濃度小時(shí)，蛋白質(zhì)易被吸附，吸附后也不容易被洗脫。因此，在離子交換層析中，一般采用兩種方法達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。一種是增加洗脫液的離子強(qiáng)度，一種是改變洗脫液的pH值。pH值增高時(shí)，抑制蛋白質(zhì)陽(yáng)離子化，隨之對(duì)陽(yáng)離子交換劑的吸附力減弱。pH值降低時(shí)，抑制蛋白質(zhì)陰離子化，隨之降低了蛋白質(zhì)對(duì)陰離子交換劑的吸附。當(dāng)使用陰離子交換劑時(shí)，增加鹽離子，則降低pH值。當(dāng)使用陽(yáng)離子交換劑時(shí)，增加鹽離子濃度，則升高溶液pH值。
（二）常用離子交換劑的種類(lèi)與特性
1.離子交換纖維素 離子交換纖維素的種類(lèi)很多，其種類(lèi)與特性如表1－1所示。
表1-1 離子交換劑的類(lèi)型與特點(diǎn)
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交換劑
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名 稱(chēng)（纖維素）
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作 用 基 團(tuán)
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特 點(diǎn)
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陰離子
交換劑
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二乙氨基乙基
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DEAE -O-C2H4N (C2H5)2H
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最常用在pH8.6以下
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三乙氨基乙基
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DEAE -O-C2H4N (C2H5)2H
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氨乙基
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AE -O-C2 H4-N H2
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胍乙基
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強(qiáng)堿性、極高pH仍有效
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陽(yáng)離子
交換劑
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羧甲基
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CM—-O-CH2-COO—
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最常用在pH4以上
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磷酸
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P－-O- P O2－
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用于低pH
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磺甲基
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SM－-O-CH2-SO3－
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磺乙基
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SE－-O-C2H4-SO3－
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強(qiáng)酸性用于極低pH
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在交換纖維素中，最常用的是DEAE—纖維素和CM纖維素。由于劑型不同，其理化性質(zhì)和作用也有所差異。一般而言，微粒型要優(yōu)于纖維素型，因?yàn)槲⒘Ｐ褪窃诶w維素型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提煉而成。它的交換容量大，粒細(xì)、比重大，能裝成緊密的層析柱，要求分辨力高的實(shí)驗(yàn)可用此型纖維素（見(jiàn)表1－2）。
表1-2 商品DEAE—纖維素和C M纖維素的類(lèi)型和特性
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纖維素
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形狀
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長(zhǎng)度
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交換當(dāng)量
（毫克當(dāng)量/克）
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蛋白質(zhì)吸附容量
（mg /g牛血清白蛋白）
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床體積（ml / g）
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pH 6.0
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pH 7.6
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DE-22
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改良纖維
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12~400
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1.0±0.1
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450
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7.7
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7.7
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DE-23
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改良纖維
（除細(xì)粒）
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18~400
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450
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8.3
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9.1
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DE-32
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微粒型（干）
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24~63
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660
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6.0
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6.7
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DE-52
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微粒型（濕）
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24~63
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660
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6.0
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6.3
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DE-11
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舊型號(hào)
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50~250
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130
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與以上相應(yīng)
型號(hào)同
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溶菌酶pH5
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CM-22
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0.6±0.06
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600
|
7.7
|
7.7
|
||
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CM-23
|
600
|
9.1
|
9.1
|
|||
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CM-32
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1 260
|
6.8
|
6.7
|
|||
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CM-52
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1.0±0.1
|
1 260
|
6.8
|
6.7
|
||
離子交換纖維素的優(yōu)點(diǎn)為：①離子交換纖維素為開(kāi)放性長(zhǎng)鏈，具有較大的表面積，吸附容量最大；②離子基團(tuán)少，排列稀疏，與蛋白質(zhì)結(jié)合不太牢固，易于洗脫；③具有良好的穩(wěn)定性，洗脫劑的選擇范圍廣。
2．離子交換交聯(lián)葡聚糖 離子交換交聯(lián)葡聚糖也是廣泛使用的離子交換劑，它與離子交換纖維素不同點(diǎn)是載體不同，常用交聯(lián)葡聚糖的類(lèi)型與特性見(jiàn)表1-3。
表1-3 常用交聯(lián)葡聚糖的類(lèi)型與特性
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類(lèi) 型
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性 能
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離子基因
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反離子
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總交換容量
（毫克當(dāng)量/g）
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DEAE-sephadexA-25
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弱堿性、陰離子交換劑
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DEAE
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Cl—
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3.5±0.5
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DEAE-sephadexA-50
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QAE-sephadex-25
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弱堿性、陰離子交換劑
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QAE
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Cl—
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3.0±0.4
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QAE-sephadex A-50
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CM-A- sephadex 25
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弱堿性、陽(yáng)離子交換劑
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CM—
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Na
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4.5±0.5
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CM- sephadex A-50
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SP- sephadex A-25
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強(qiáng)堿性、陽(yáng)離子交換劑
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SP—
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Na
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2.3±0.3
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SP- sephadex A-50
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離子交換交聯(lián)葡聚糖有如下優(yōu)點(diǎn)：①不會(huì)引起被分離物質(zhì)的變性或失活；②非特異性吸附少；③交換容量大。
離子交換葡聚糖的選用，一般根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量而定。中等分子量（30 000-200 000）一般選A50和C50，而低分子量（＜30 000和高分子量＞200 000）均宜選用A25和C25。
（三）試驗(yàn)方法
陰離子交換劑與陽(yáng)離子交換劑的裝柱和層析過(guò)程基本相同。交聯(lián)葡聚糖的預(yù)處理只需充分溶脹和平衡，不需要除去細(xì)粒碎片和酸堿處理。其他步驟也基本同離子交換纖維素。
1．劑型的選擇 根據(jù)蛋白質(zhì)在所用緩沖液pH值下帶電荷的種類(lèi)選擇，如pH高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，應(yīng)選陰離子交換劑，反之應(yīng)選陽(yáng)離子交換劑。一般情況下，DEAE-纖維素用于分離酸性蛋白，而CM纖維素用于分離堿性蛋白質(zhì)。
下面以DEAE-纖維素操作為例，介紹試驗(yàn)方法
2．膨脹活化 此步的目的在于除去雜質(zhì)，暴露DEAE-纖維素上的極性基團(tuán)。DEAE-纖維素的用量則根據(jù)柱容積的大小和所需過(guò)柱樣品的量來(lái)決定。一般是1.0g DEAE-纖維素相當(dāng)于6ml～8ml柱床體積。
表1－4 分離的血清與所需DEAE—纖維素量及其他條件的大致關(guān)系
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血清樣品量（ml）
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DEAE需用量（g）
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選層析柱規(guī)格（cm）
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選脫液量（ml）
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1~2
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2
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1×25
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100~150
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5
|
5
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2×12
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200~300
|
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10
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10
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2×20
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300~400
|
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20
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20
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2×37
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400~800
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稱(chēng)取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE—纖維素干粉約需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不時(shí)攪拌。抽濾（以布氏漏斗加兩層濾紙或尼龍紗布抽濾），以蒸餾水洗滌，再抽濾，直至濾液近中性為止，再將纖維素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同樣抽濾液至近中性。再將纖維素浸于0.5Mol/L NaOH液中，同樣處理，洗至中性。
3．平衡 將DEAE—纖維素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始緩沖液），靜止1h，不時(shí)攪拌，待纖維素下沉后，傾去上清液或抽濾除去洗液，如此反復(fù)幾次至傾出液體的pH值與加入的PB液的pH值相近時(shí)為止。
4．裝柱 層析柱的選擇要大小、長(zhǎng)度適當(dāng)。一般而言，柱長(zhǎng)和柱直徑之比為10︰1～20︰1，柱的內(nèi)徑上下要均勻一致。用前將層析柱在清潔液內(nèi)浸泡處理24h，然后依次用常水、蒸餾水、起始緩沖液充分洗滌。
裝柱時(shí)，先剪一塊圓形的尼龍紗布（直徑與層析柱內(nèi)徑一致），放入層析柱底部。將柱下端連接細(xì)塑料管，夾上螺旋夾。把層析柱垂直固定在三角鐵架上，倒入起始緩沖液至一半的柱高，除去死區(qū)及塑料管內(nèi)的氣泡。再將平衡的DEAE－纖維素糊狀物沿管壁倒入柱中。注意不要產(chǎn)生氣泡，如有氣泡應(yīng)排除或重裝。擰開(kāi)螺旋夾，使流速至1ml/5min，待緩沖液快接近纖維素面時(shí)，繼續(xù)倒入纖維素糊，同時(shí)用玻璃棒攪拌表面層，以免使兩次加入的纖維素形成分界層，通過(guò)進(jìn)出緩沖液調(diào)節(jié)流量，也可通過(guò)塑料管的升降來(lái)控制，至柱床體積不變?yōu)橹�。剪一圓形濾紙（與柱內(nèi)徑大小一致），從柱的上端輕輕放入，使其沉接于纖維素床表面，以免在加樣時(shí)打亂纖維素層。裝好柱的柱面應(yīng)該是平整的，無(wú)傾斜，整個(gè)柱床內(nèi)無(wú)氣泡、不分層。繼續(xù)平衡，使流出液的pH值與流入液的pH值完全一致為止。
5．上樣 要層析的樣品首先必須用起始緩沖液（4℃）平衡過(guò)夜，中間可換液數(shù)次。將柱的上端打開(kāi)，用吸管將纖維素柱上面的緩沖液吸出，不要吸凈，留一薄層液面，以免空氣進(jìn)入。沿管壁緩緩加入樣品，注意不要打亂纖維素表層。擰開(kāi)下端的螺旋夾，使樣品進(jìn)入交換劑中，快要進(jìn)完時(shí)，加1ml～2ml緩沖液沖洗柱壁，隨即用多量的洗脫液洗脫。
樣品的加量與DEAE—纖維素有一個(gè)最適比的關(guān)系，超過(guò)這個(gè)比值，吸附就不完全，直接影響到分離的純度。經(jīng)過(guò)粗提的 —球蛋白50mg～100mg，用干重約4g DEAE－纖維素裝柱分離，可獲得理想結(jié)果。
6．洗脫 對(duì)于陰離子交換劑而言，洗脫的辦法是使pH逐漸降低，而離子濃度逐漸升高。一般的辦法，是穩(wěn)定一個(gè)因素而改變另一個(gè)因素洗脫。洗脫可采用分段洗脫和連續(xù)洗脫法，前者較實(shí)用，后者較準(zhǔn)確。
表1－5 血清蛋白各成分的吸附與解吸的關(guān)系
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成 分
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等電點(diǎn)
|
DEAE吸附能力
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解吸順序
|
|
白蛋白
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4.9
5.6
5.1
7.3
|
強(qiáng)
弱
|
后
先
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表1－6 血清的分段洗脫成分
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NaCl濃度（Mol/L）
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0.01Mol/L PB（pH）
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洗脫部分
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|
0.025
|
8.0
|
IgG
|
|
0.030
|
7.0
|
IgG
|
|
0.040
|
7.0
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運(yùn)鐵蛋白、纖維蛋白原
|
|
0.060
|
6.5
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白蛋白、IgA
|
|
0.150
|
6.5
|
IgM 白蛋白
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表1－7 各種Ig解脫吸附條件
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不加NaCl PB離子強(qiáng)度（Mol/L）
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pH
|
Ig
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其他
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0.01
|
8.0
|
IgG
|
|
|
0.025
|
8.0
|
IgE
|
|
|
0.035
|
7.0
|
IgA
|
|
|
0.040
|
5.9
|
球蛋白
|
|
|
0.10
|
5.8
|
白蛋白
|
|
|
0.40
|
5.2~4.5
|
IgM
|
球蛋白
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7．洗脫液的收集 利用自動(dòng)分步收集器收集，并以20%磺基水楊酸測(cè)試，當(dāng)?shù)鞍滓合聛?lái)時(shí)，開(kāi)始分管收集，至無(wú)蛋白液為止。
8．交換柱的再生 將使用過(guò)的DEAE－纖維素移入燒杯中，用2Mol/L NaCl液浸泡，抽濾并洗滌數(shù)次。如不立即使用，可加1/10 000的疊氮鈉防腐，保存于4℃冰箱中。使用時(shí)，再以堿－酸－堿處理。
