VIP標(biāo)識(shí) 上網(wǎng)做生意,首選VIP會(huì)員| 設(shè)為首頁(yè)| 加入桌面| | 手機(jī)版| RSS訂閱
食品伙伴網(wǎng)服務(wù)號(hào)
 

凝膠層析技術(shù)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28
凝膠層析又稱為分子篩層析或凝膠過(guò)濾。具有分子篩作用的物質(zhì)很多,如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。以葡聚糖凝膠應(yīng)用最廣,商品名是sephadex型號(hào)很多,從G10到G200,它的主要應(yīng)用范圍是:①分級(jí)分離各種抗原與抗體;②去掉復(fù)合物中的小分子物質(zhì)。如除鹽、熒光素和游離的放射性同位素以及水解的蛋白質(zhì)碎片;③分析血清中的免疫復(fù)合物;④分子量的測(cè)定。
(一)原理
凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質(zhì),當(dāng)帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內(nèi)運(yùn)動(dòng)時(shí),由于它們的分子量不同而表現(xiàn)出速度的快慢,在緩沖液洗脫時(shí),分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi),而在凝膠間幾乎是垂直的向下運(yùn)動(dòng),而分子量小的物質(zhì)則進(jìn)入凝膠孔內(nèi)進(jìn)行“繞道”運(yùn)行,這樣就可以按分子量的大小,先后流出凝膠柱,達(dá)到分離的目的。
(二)葡聚糖凝膠的種類與性能
葡聚糖又名右旋糖酐,在它們的長(zhǎng)鏈間以三氯環(huán)氧丙烷交聯(lián)劑交聯(lián)而成。葡聚糖凝膠具有很強(qiáng)的吸水性,交聯(lián)度大,吸水性小,相反交聯(lián)度小,吸水性大。商品名以SephadexG表示,G值越小,交聯(lián)度越大,吸水性越小,G值越大,交聯(lián)度越小,吸水性就越大,二者呈反比關(guān)系,G值大約為吸水量的10倍。由此可以根據(jù)床體積而估算出葡聚糖凝膠干粉的用量。
表 Sephadex1的種類與特性
型號(hào)
分離范圍
(分子量)
吸水量
(ml/g)
最小溶脹時(shí)(h)
20℃~25℃ 100℃
床體積(ml)/干凝膠(mg)
G10
<700
1.0±0.1
3 1
2~3
G15
<1 500
1.5±0.2
3 1
2.5~3.5
G25
<5 000
2.5±0.2
3 1
4~6
G50
1500~20 000
8.0±0.3
3 1
9~11
G75
3 000~70 000
7.5±0.5
24 1
12~15
G100
4 000~15 000
10.0±1.0
72 1
15~20
G150
5 000~800 000
15.0±1.5
72 1
20~30
G200
5 000~30 0000
20.0±2.0
72 1
30~40
G25、G50有四種顆粒型號(hào):粗(100µ~300µ)、中(50µ~150µ)、細(xì)(20µ~80µ)和超細(xì)(10µ~40µ)。G75G200又有兩種顆粒型號(hào):中(40µ~120µ),超細(xì)(10µ~40µ)。顆粒越細(xì),流速越慢,分離效果越好。
表 DEAE-纖維素與Sephadex1比較
項(xiàng) 目
DEAE纖維素
Sephadex
交換量
較大
非特異性吸附
較大
分離純度
較好
分離時(shí)間
較粗
較長(zhǎng)
應(yīng)用范圍
較窄
較寬
預(yù)處理
繁瑣
方便
(三)試驗(yàn)方法
1.凝膠的選擇 根據(jù)層析物質(zhì)分子量的大小選擇不同型號(hào)的凝膠,如除鹽和除游離的熒光素,則可選用粗、中粒度的G28或G500,G250多用于分離蛋白質(zhì)單體,G200多用于分離蛋白質(zhì)凝膠聚合體等。
2.凝膠的預(yù)處理 稱取適量的凝膠加入過(guò)量的緩沖液在冰箱(或室溫)中充分膨脹,或在沸水中煮,膨脹時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同型號(hào)的凝膠而定。
表 凝膠量與型號(hào)和層析柱大小與規(guī)格及凝膠用量
層析柱規(guī)格
凝膠的規(guī)格和用量(g)
直徑(cm)
高(cm)
容量(ml)
G25
G50
G100
G200
0.9
15
9.5
2.5
1
0.6
0.3
0.9
30
19
5
2
1.2
0.6
0.9
60
38
10
4
2.5
1.2
1.6
20
40
10
4
2.5
1.2
1.6
40
80
20
8
5.0
2.4
1.6
70
140
35
14
9.0
4.4
1.6
100
200
50
20
12.5
6
2.6
40
210
50
20
12
7
2.6
70
370
90
35
20
12
2.6
2.6
100
60
530
1 000
130
250
50
110
30
70
17
35
為使粒子均勻一致需進(jìn)行浮選,即加入凝膠粒子后,輕輕攪拌,靜置20min,傾去沉淀的粒子,如此反復(fù)數(shù)次即可。
3.裝柱 層析柱的選擇一般根據(jù)分離樣品的種類和樣品的數(shù)量而定。純化蛋白質(zhì)時(shí),柱床體積應(yīng)為樣品體積的25~100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的4~10倍。柱太短,影響分離效果。柱長(zhǎng)一些,分離效果好,但柱太長(zhǎng),則延長(zhǎng)分離時(shí)間,樣品也稀釋過(guò)度。層析柱的內(nèi)徑也要選擇適當(dāng)。內(nèi)徑過(guò)細(xì),會(huì)發(fā)生“器壁效應(yīng)”,即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內(nèi)徑和高度應(yīng)有一定的比例。對(duì)于除鹽來(lái)說(shuō)應(yīng)為1︰5~1︰25;對(duì)于純化蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)應(yīng)為1︰20~1︰100。
裝柱過(guò)程基本同離子交換層析柱。
4.加樣與洗脫 樣品體積不宜過(guò)多,最好為床體積的1%~5%,最多不要超過(guò)10%。樣品濃度也不宜過(guò)大,濃度過(guò)大粘度大,分離效果差,一般不超過(guò)4%。
洗脫液應(yīng)與膨脹一致,否則更換溶劑,凝膠體積會(huì)發(fā)生變化,影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強(qiáng)度和pH值。分離血清蛋白常用0.02~0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液(0.14Mol/L NaCl)和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液(0.14Mol/L NaCl)。
5.洗脫液收集 同離子交換層析。
6.凝膠柱的重復(fù)使用與保存 當(dāng)樣品的各組分全部洗脫下來(lái)之后,即可加入新的樣品,繼續(xù)使用。保存方法有三種:
⑴ 在液相中保存最方便,即于凝膠懸液中加入防腐劑(一般為0.02%N2N3或0.002%洗必泰)或高壓滅菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。
⑵ 用完后,以水沖洗,然后用60%~70%酒精液沖洗,凝膠體積縮小,即在半收縮狀態(tài)下保存。
⑶ 長(zhǎng)期不用者,最好以干燥狀態(tài)保存,即水洗凈后,用含乙醇的水洗,逐漸加大乙醇用量,最后用95%的乙醇洗,可全部去水,再用乙烯去除乙醇,抽濾干,于60℃~80℃干燥后保存。
 
[ 網(wǎng)刊訂閱 ]  [ 食品專題搜索 ]  [ ]  [ 告訴好友 ]  [ 打印本文 ]  [ 關(guān)閉窗口 ] [ 返回頂部 ]

 

 
推薦圖文
推薦食品專題
點(diǎn)擊排行
 
 
Processed in 0.016 second(s), 17 queries, Memory 0.91 M