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等電聚焦電泳技術

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28
(一)原理
等電聚焦技術是一種根據(jù)樣品的等電點不同而使它們在pH梯度中相互分離的一種電泳技術。
本法的分辯率極高,所以在進行等電聚焦電泳時,要求樣品不能過于復雜,一般應經其他方法(如層析法)提純后再進行等點聚焦,才能得到比較滿意的結果。如利用人的純IgG再經過等電聚焦電泳,可以滿意地分離IgG的四個亞類。如IgG2濃縮于pH7.0的部位,IgG3濃縮于pH8.0~9.0的范圍內,IgG4則濃縮于pH6.0以下的部位,而IgG則分布于全部pH范圍,且只有IgG1能存在于pH9.0以上的部位。
等電聚焦電泳與其他分離方法結合起來,將是一項很有前途的分析鑒定和制備樣品的好技術。
(二)器材與試劑配制
1.聚焦柱 有成品出售,分110ml和440ml兩種。
2.電源 0V~1 200V可調20W的直流穩(wěn)壓電源。
3.載體兩極電解質 市售25ml瓶裝,濃度為40%或20%(W/V),pH范圍為2.5~11,也有其它pH范圍的,可根據(jù)實驗條件選擇購買。
4.蔗糖(分析純)
1. 電極液的配制見表:
表 正電極緩沖液的配制
正極在中心管內
正極在柱頂
磷酸
或硫酸
0.05(0.2)ml或1(4)ml
1Mol/L 酸溶液
0.025(0.1)ml或0.5(2)ml
1Mol/L 酸溶液
H2O
15(56)ml
5(25)ml
蔗糖
11(44)g
表2-3 負極緩沖液的配制
負極在中心管
負極在柱頂
氫氧
化鈉
0.1(0.4)g或1(4)ml
0.05(0.2)g或0.5(2)ml
2Mol/L 溶液
2Mol/L 溶液
蒸餾水
14(56)ml
5(25)ml
蔗糖
11(44)g
此配制用量為最大用量,一般用1/5的量即可。括號內為440ml聚焦柱型號所用量配方。
6.重、輕液的配制與混合
⑴重、輕液的配制:配制方法見表:
表 重、輕液的配制方法
110ml柱
440ml柱
載體40%(ml)
水及蛋白質溶液(ml)
蔗糖(g)
重液
1.9
37
26
輕液
0.6
51.5
重液
7.6
148
104
輕液
2.4
206
         
此表為梯度混合器所用量,如用手工混合法則應相應適當增加20%。
⑵重、輕液的混合:有條件的可采用梯度混合器裝柱。手工混合法操作如下:取24支試管(440ml聚焦柱則應取46支試管)按2-5表各加入重、輕液,充分混勻。
試管號
重液(ml)
輕液(ml)
試管號
重液(ml)
輕液(ml)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
4.6
4.4
4.2
4.0
3.8
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
2.4
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
4.0
4.2
4.4
4.6
(二)操作方法
1.決定電極的極性 如pH梯度范圍在6以下時,則聚焦柱底的電極為正極。如pH梯度的范圍在6以上時,則柱底為負極。原因是蔗糖濃度越大,電導越小,所以在等電點pH6~7的載體處,應該避免蔗糖濃度最大的部位。
2.裝柱 按電極的極性與電極液的要求裝柱。將聚焦柱垂直放置,先注入底部電極液,打開中心管下端的活塞,從中心管上端,用帶長膠管的注射器注入電極液,使液面在中心管下部開口處之上達1cm處即可。
3.注入載體溶液 加完后應使電極液仍浸沒中心管的下部開口,不使電極與載體溶液直接接觸。
4.加重、輕混合液 從1號試管加起,用注射器沿管壁緩緩加入,流速約3ml/min,全部重、輕混合液加完后,再在上部加電極液,使上部電極浸沒。
5.連接冷凝水管。
6.電泳 電壓300V。開始電泳時,由于載體分子都不處于等電狀態(tài),所以它們都帶電,在電場影響下向各自的等電點移動,因此開始時電流較大,以后逐漸減小。所以在開始時電壓可稍低一些。電泳結束時電流約為0.30mA,電泳時間2~3天。
7.樣品的收集 斷電后,關閉中心管下端活塞以免電極液流出,放入樣品,流速2ml/min為宜。以部分收集器收集,每管2ml。
8.測每管的pH值和蛋白含量,將相近pH的同一蛋白質的管合并。
9.將分離的每一樣品成分過SepHadexG25(或G50),將蛋白質與載體分離開來。

 

 

 

 
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