增加PCR的特異性：
1. primers design
這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些條件
a. 足夠長(zhǎng),18-24bp,以保證特異性.當(dāng)然不是說(shuō)越長(zhǎng)越好,太長(zhǎng)的引物同樣會(huì)降低特異性,并且降低產(chǎn)量
b. GC% 40%~~~~60% c. 5'端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性
d. 避免3'端GC rich, 最后3個(gè)BASE不要有GC,或者最后5個(gè)有3個(gè)不要是GC
e. 避免3'端的互補(bǔ), 否則容易造成DIMER f. 避免3'端的錯(cuò)配 g. 避免內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)
h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時(shí)不算,但在檢測(cè)互補(bǔ)和二級(jí)結(jié)構(gòu)是要加上它們
i. 使用兼并引物時(shí), 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用 較高的引物濃度(1uM-3uM)
j. 最好學(xué)會(huì)使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.
* 引物的另一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度.Tm對(duì)于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火， 同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的 Tm低5℃。
設(shè)定Tm有幾種公式。有的是來(lái)源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。
有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和 相鄰堿基的特性預(yù)測(cè)引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法。
根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會(huì)差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋�(gè)估算的Tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)�？梢酝ㄟ^(guò)分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開(kāi)始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。
為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對(duì)的Tm差異如果超過(guò)5℃，就會(huì)引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃
或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
2. stability of primers
定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對(duì)于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。
引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因?yàn)樗膒H經(jīng)常偏酸，會(huì)引起寡核苷的水解。 引物的穩(wěn)定性依賴于儲(chǔ)存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲(chǔ)存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在 -20℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個(gè)月。
3. optimize reactants concentration
a. magnesiom ions
Mg離子的作用主要是 dNTP-Mg 與核酸骨架相互作用 并能影響Polymerase的活性，一般的情況下 Mg的濃度在0.5-5mM之間調(diào)整，同樣要記住的是在調(diào)整了dNTPs的濃度后要相應(yīng)的調(diào)整Mg離子的濃度，對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液
b. 其他的離子
NH4 K 都會(huì)影響PCR，增加K 的濃度后, 會(huì)因?yàn)橹泻土撕怂峁羌苌狭姿峄鶊F(tuán)的負(fù)電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的 嚴(yán)謹(jǐn)性(stringency)，NH4 也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了兩種BUFFER, 一種是加Mg的一種是已經(jīng)混合了(NH4)2SO4的，當(dāng)然, 過(guò)高的陽(yáng)離子濃度(KCL>0.2M)時(shí), DNA在94度根本不會(huì)發(fā)生變性, 當(dāng)然也就無(wú)從談起PCR了.
c. polymerase
不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度，一些高保真沒(méi)的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情況下, 變性的溫度可以使用90~92度, 變性的時(shí)間也可以縮短,從而保證polymerase的活性
d. template
50ul PCR SYSTEM
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human gDNA 0.1ug-1ug
E.Coli 10ng-100ng
LamadaDNA 0.5ng-5ng
Plasmid DNA 0.1ng-10ng
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4. termperature
a. denaturation
常規(guī)是94度5分鐘, GC Rich的摸板是95度5分鐘
除了GC Rich外, 常規(guī)的APPLICATIONS可以將這部分時(shí)間縮短到1到2分鐘, 或者在CYCLE 1時(shí)給予較長(zhǎng)的時(shí)間,而取消開(kāi)始的denaturation
b. annealing
重點(diǎn)到了：一般情況下, 是從55度開(kāi)始.根據(jù)情況配合以Mg離子濃度進(jìn)行調(diào)整. 有條件的可以做gradient pcr. 退火的時(shí)間在30-60S, 時(shí)間短一些可以得到更好的效果. 因?yàn)? polymerase 在 annealing temp.時(shí)也會(huì)有一些活性. 所以在A.T.的時(shí)間過(guò)長(zhǎng), 會(huì)極大的增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)，另外,在對(duì)于一些困難戶, 比如從gDNA里擴(kuò)增大片段, 還可使用two step PCR.
5. touchdown PCR
原理很簡(jiǎn)單,但的確是一個(gè)很有用的方法。舉個(gè)例子，ANNEALING TEMP. 55度
94 5min 94 30s 60 30s 72 1min 2cycles 94 30s 59 30s
72 1min 2cycles 94 30s 58 30s 72 1min 2cycles 94 30s
51 30s 72 1min 2cycles 94 30s 50 30s
72 1min 20cycles 72 5min
6. hot start PCR
熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過(guò)程中，以及在熱循環(huán)剛開(kāi)始，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時(shí)，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng)PCR尤為有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法 簡(jiǎn)單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。
熱啟動(dòng)通過(guò)抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合 酶，在反應(yīng)體系達(dá)到90度時(shí)，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這個(gè)方法 過(guò)于煩瑣， 尤其是對(duì)高通量應(yīng)用，并容易造成污染。其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種基本 成分，入鎂離子或酶，包裹起來(lái)，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開(kāi)。在熱循環(huán)時(shí)， 因蠟熔化而把各種成分釋放出來(lái)并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。
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ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)
Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)
Magnesium wax beads (Stratagene).
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象手動(dòng)熱啟動(dòng)方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。
還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗體抑制失活，當(dāng)變性溫度超過(guò)70度時(shí)，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。
7. Booster PCR
我們知道1ug human genomic DNA 大約在3X10 5冪個(gè)模板分子,這樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結(jié)合. 當(dāng)模板的濃度過(guò)低,比如低于100個(gè)分子時(shí), 引物和模板之間就很難發(fā)生反應(yīng). 引物容易自身進(jìn)行反應(yīng)形成二聚體.這樣就有來(lái)了個(gè) booster PCR 我一直找不到合適的詞來(lái)翻譯這個(gè)booster.
具體是這樣的.開(kāi)始幾個(gè)cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的molar ratio在10 7~ 10 8. 以確保開(kāi)始擴(kuò)增的準(zhǔn)確性.然后booste Primer的濃度到正常的水平
8. 循環(huán)數(shù)和長(zhǎng)度
確定循環(huán)數(shù)的基本原理是: 產(chǎn)物能夠保證你進(jìn)一步分析操作的最小循環(huán)數(shù).因?yàn)檫^(guò)多的循環(huán)數(shù)容易造 成ERRORS和非特異性產(chǎn)物的積累 產(chǎn)物的量不夠, 優(yōu)化的方法有:
1. 增加TEMPLATE
2. 增加循環(huán)數(shù)
如何確定循環(huán)數(shù),有一個(gè)方法.
做一個(gè)PCR體系,40循環(huán),50ul, 分別在20,25,30,35循環(huán)時(shí)從體系中取5ul,一起跑電泳分析.從而確定最佳的循環(huán)數(shù)
另一個(gè)會(huì)影響PCR特異性的是PCR cycling時(shí)在兩個(gè)溫度間變化的速率(ramping rate).當(dāng)然是越高 越好.不過(guò)咱們大部分條件有限,就那么幾臺(tái)PCR儀,也沒(méi)有多少挑選的余地
9. thermal cycler
PCR儀的因素我們經(jīng)常容易忽視.長(zhǎng)時(shí)間的使用后需要調(diào)整PCR儀,以保證其能夠到達(dá)正確的溫度.現(xiàn)在的PCR儀基本上都有自檢功能(self-diagnosis).
10. PCR additives
附加物或者說(shuō)enhancer實(shí)在是多種多樣. 基本上包括幾類, 能夠增加反應(yīng)退火效率的化學(xué)因子, DNA結(jié)合蛋白和一些商業(yè)試劑. 基本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯(cuò)配, 增加產(chǎn)物的長(zhǎng)度和產(chǎn)量.
在GC Rich情況中, additive可以造成配對(duì)堿基間的的不穩(wěn)定,從而提高擴(kuò)增的效率.而在另一種情況下,additive由于造成錯(cuò)配的primer-template復(fù)合物的極大的不穩(wěn)定, 而提高了擴(kuò)增的忠實(shí)性.要注意的是,沒(méi)有萬(wàn)能的enhancer全部通用,需要你根據(jù)自己的情況,最好結(jié)合gradient pcr選擇最優(yōu)條件.
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dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%
formamide at 5%
trimethylammonium chloride 10-100uM
detergents such as Tween 20 0.1-2.5%
polyethylene glycol (PEG)6000 5-15%
glycerol 10-15%
single stranded DNA binding proteins
Gene 32 protein 1nM
E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM
7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP
Taq Extender (stratagene)
Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)
Q-solution(Qiagen)
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要注意的是,DMSO,GLYCEROL等會(huì)抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最適的濃度
11. Template DNA preparation
提取DNA時(shí)的試劑會(huì)抑制PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行.因此需要對(duì)TEMPLATE DNA進(jìn)行純化.特別是SDS(<0.01%) 的情況下就能強(qiáng)烈抑制PCR的進(jìn)行. 可以加入一些nonionic試劑,如Tween, Nonid, Trition之類的反過(guò)來(lái)抑制SDS. 還有proteinase K也要除干凈, 不然會(huì)降解polymerase.
12. Nested PCR
簡(jiǎn)單點(diǎn)說(shuō) 設(shè)計(jì)兩對(duì)引物, 一對(duì)是長(zhǎng)的, 一對(duì)是包含在長(zhǎng)引物內(nèi)的, 用長(zhǎng)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物作為第二次擴(kuò)增的模板,這樣可以增加產(chǎn)物的量. 而且可以減少非特異性帶和錯(cuò)配的情況.
增加PCR的保真性
高保真酶
高溫DNA POLYMERASE是以單鏈DNA或RNA為模板，在dNTP和一些陽(yáng)離子的存在情況下，在特定的引物指導(dǎo)下按3'-5'方向合成DNA.包括3種類型
a.5'-3'方向的DNA合成能力,沒(méi)有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突變體.這類酶的合成能力強(qiáng),因?yàn)樗患m正合成中出現(xiàn)的突變
b.與a類似,有合成活性,沒(méi)有3-5的外切活性.但他們能以RNA為模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerase
c.有DNA聚合活性,沒(méi)有逆轉(zhuǎn)錄活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠實(shí)性。但是這些聚合酶的產(chǎn)量比Taq DNA聚合酶低。
酶的混合物
將Taq DNA聚合酶同帶有3'到5'外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨(dú)Taq DNA聚合酶高的忠實(shí)性，并可以得到高產(chǎn)量及擴(kuò)增長(zhǎng)模板。
其他因素
除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會(huì)降低忠實(shí)性。將dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以增加精確度如果四種核苷的濃度不同，忠實(shí)性會(huì)受影響。進(jìn)行較少的PCR循環(huán)也會(huì)有助于增加忠實(shí)性，因?yàn)樵黾友h(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長(zhǎng)度就會(huì)增加突變可能性。
1．簡(jiǎn)介
寡聚核苷酸引物的選擇，通常是整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)成功的關(guān)鍵。所選的引物序列將決定PCR產(chǎn)物的大小、位置、以及擴(kuò)增區(qū)域的Tm值這個(gè)和擴(kuò)增物產(chǎn)量有關(guān)的重要物理參數(shù)。好的引物設(shè)計(jì)可以避免背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，甚至在RNA-PCR中也能識(shí)別cDNA或基因組模板。引物設(shè)計(jì)也極大的影響擴(kuò)增產(chǎn)量：若使用設(shè)計(jì)粗糙的引物，產(chǎn)物將很少甚至沒(méi)有；而使用正確設(shè)計(jì)的引物得到的產(chǎn)物量可接近于反應(yīng)指數(shù)期的產(chǎn)量理論值。當(dāng)然，即使有了好的引物，依然需要進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，比如調(diào)整Mg2 濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。
計(jì)算機(jī)輔助引物設(shè)計(jì)比人工設(shè)計(jì)或隨機(jī)選取更有效。一些影響PCR反應(yīng)中引物作用的因素諸如溶解溫度、引物間可能的同源性等，易于在計(jì)算機(jī)軟件中被編碼和限定。計(jì)算機(jī)的高速度可完成對(duì)引物位置、長(zhǎng)度以及適應(yīng)用戶特殊條件的其他有關(guān)引物的變換可能性的大量計(jì)算。通過(guò)對(duì)成千種組合的檢測(cè)，調(diào)整各項(xiàng)參數(shù)，可提出適合用戶特殊實(shí)驗(yàn)的引物。因此通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件選擇的引物的總體“質(zhì)量”（由用戶在程序參數(shù)中設(shè)定）保證優(yōu)于通過(guò)人工導(dǎo)出的引物。
需要指出的是，引物不必與模板完全同源，因此可包含啟動(dòng)子序列、限制酶識(shí)別位點(diǎn)或5’端的各種修飾，這種對(duì)引物的修飾不會(huì)妨礙PCR反應(yīng)，而會(huì)在以后使用擴(kuò)增子時(shí)發(fā)揮作用。
2．基本PCR引物設(shè)計(jì)參數(shù)
引物設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。特異性是指發(fā)生錯(cuò)誤引發(fā)的頻率。特異性不好或劣等的引物會(huì)產(chǎn)生額外無(wú)關(guān)和不想要的PCR擴(kuò)增子，在EB染色的瓊脂糖凝膠上可見(jiàn)到；引物效率是指在每一PCR循環(huán)中一對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物與理論上成倍增長(zhǎng)量的接近程度。
①引物長(zhǎng)度；
特異性一般通過(guò)引物長(zhǎng)度和退火溫度控制。如果PCR的退火溫度設(shè)置在近于引物Tm值（引物/模板雙鏈體的解鏈溫度）幾度的范圍內(nèi)，18到24個(gè)堿基的寡核苷酸鏈?zhǔn)怯泻芎玫男蛄刑禺愋缘�。引物越長(zhǎng)，擴(kuò)增退火時(shí)被引發(fā)的模板越少。為優(yōu)化PCR反應(yīng)，使用確保溶解溫度不低于54℃的最短的引物，可獲得最好的效率和特異性。
總的來(lái)說(shuō)，最好在特異性允許的范圍內(nèi)尋求安全性。每增加一個(gè)核苷酸，引物特異性提高4倍；這樣，大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸。引物設(shè)計(jì)時(shí)使合成的寡核苷酸鏈（18～24聚物）適用于多種實(shí)驗(yàn)條件仍不失為明智之舉。
②引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)
包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會(huì)影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對(duì)于引物的3’末端形成的二聚體，應(yīng)控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三個(gè)連續(xù)的堿基互補(bǔ)，因?yàn)榇朔N情形的引物二聚體有進(jìn)一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性，引物中間或5’端的要求可適當(dāng)放寬。引物自身形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，也以3’端或近3’端對(duì)引物-模板結(jié)合影響更大；影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補(bǔ)配對(duì)的鍵能之外，與莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免3’末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。
③引物GC含量和Tm值
PCR引物應(yīng)該保持合理的GC含量。含有50％的G C的20個(gè)堿基的寡核苷酸鏈的Tm值大概在56～62℃范圍內(nèi)，這可為有效退火提供足夠熱度。一對(duì)引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。協(xié)調(diào)性差的引物對(duì)的效率和特異性都較差，因?yàn)榻档土薚m值導(dǎo)致特異性的喪失。這種情況下引物Tm值越高，其錯(cuò)誤引發(fā)的機(jī)率也越大。若采用太高的退火溫度，Tm值低的引物對(duì)可能完全不發(fā)揮作用。在從一批在特定序列范圍內(nèi)已合成好的寡核苷酸中選擇一對(duì)新的引物時(shí)，這種GC含量和Tm值的協(xié)調(diào)非常關(guān)鍵。一般來(lái)說(shuō)，一對(duì)引物的Tm值相差盡量不超過(guò)2～3攝氏度，同時(shí)引物和產(chǎn)物的Tm值也不要相差太大，20攝氏度范圍內(nèi)較好。
④引物的額外序列與退火溫度
若有額外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、限制酶切位點(diǎn)或者GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以使用加長(zhǎng)的引物。一般說(shuō)來(lái)，引物5’端添加無(wú)關(guān)序列不會(huì)影響引物特異序列的退火。有時(shí)候，引物中添加了大量與模板不配對(duì)的堿基，可以在較低退火溫度的條件下進(jìn)行4到5個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；然后在假定引物5’端序列已經(jīng)加入到模板中，計(jì)算得出的退火溫度下進(jìn)行其余的循環(huán)。
在引物上添加限制酶位點(diǎn)時(shí)一個(gè)重要的考慮是大多數(shù)限制酶的有效切割要求在它們的識(shí)別序列的5’端有2至3個(gè)非特異的額外堿基，這樣就會(huì)增加引物的非模板特異序列的長(zhǎng)度。長(zhǎng)引物序列的另一個(gè)缺點(diǎn)是影響溶解溫度的精確計(jì)算，而這對(duì)于確定PCR反應(yīng)時(shí)的退火溫度又是必須的。對(duì)于低于20個(gè)堿基的引物，Tm值可以根據(jù)Tm=4(G C) 2(A T)計(jì)算。而對(duì)于較長(zhǎng)的引物，Tm值需要考慮動(dòng)力學(xué)參數(shù)、從“最近鄰位”的計(jì)算方式得到，現(xiàn)有的PCR引物設(shè)計(jì)軟件大多數(shù)都采用這種方式。
⑤引物的3’末端核苷酸組成
引物3’末端和模板的堿基完全配對(duì)對(duì)于獲得好的結(jié)果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6個(gè)核苷酸的錯(cuò)配應(yīng)盡可能的少。如果3’末端的錯(cuò)配過(guò)多，通過(guò)降低反應(yīng)的退火溫度來(lái)補(bǔ)償這種錯(cuò)配不會(huì)有什么效果，反應(yīng)幾乎注定要失敗。
引物3’末端的另一個(gè)問(wèn)題是防止一對(duì)引物內(nèi)的同源性。應(yīng)特別注意引物不能互補(bǔ)，尤其是在3’末端。引物間的互補(bǔ)將導(dǎo)致不想要的引物雙鏈體的出現(xiàn)，這樣獲得的PCR產(chǎn)物其實(shí)是引物自身的擴(kuò)增。這將會(huì)在引物雙鏈體產(chǎn)物和天然模板之間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)PCR狀態(tài)，從而影響擴(kuò)增成功。
引物3’末端的穩(wěn)定性由引物3’末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個(gè)堿基的ΔG。此值的大小對(duì)擴(kuò)增有較大的影響，負(fù)值大，則3’末端穩(wěn)定性高，擴(kuò)增效率更高，同時(shí)也更易于異位引發(fā)。
需要注意的是，引物3’末端應(yīng)盡量避免T。實(shí)驗(yàn)證明，以T結(jié)尾的引物即使與T, G或C錯(cuò)配仍可有效延伸。
⑥PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度及在耙序列內(nèi)的位置
所有的計(jì)算機(jī)程序都提供對(duì)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍的選擇。一般說(shuō)來(lái)，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度對(duì)擴(kuò)增效率有影響。特定的應(yīng)用情況下，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度部分取決于模板材料。
預(yù)期產(chǎn)物的特定長(zhǎng)度經(jīng)常取決于應(yīng)用的需要。若目的是建立測(cè)定特異DNA片段的臨床檢驗(yàn)方法，120～300bp的小DNA擴(kuò)增產(chǎn)物可能是最好的。產(chǎn)物應(yīng)具有好的特異性和高的產(chǎn)生效率，并含有能用于探針捕捉雜交實(shí)驗(yàn)的足夠信息。這一長(zhǎng)度范圍的產(chǎn)物可以通過(guò)采用兩步擴(kuò)增循環(huán)方法得到，從而減少擴(kuò)增時(shí)間。
其他PCR方法有不同的最佳產(chǎn)物長(zhǎng)度。例如，通過(guò)定量的RNA-PCR檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)，產(chǎn)物應(yīng)該足夠大以便構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)性模板，這樣，產(chǎn)物和競(jìng)爭(zhēng)物都能夠在凝膠上很容易的分辨出來(lái)。這些產(chǎn)物一般在250～750bp范圍內(nèi)。
⑦補(bǔ)充說(shuō)明
若在cDNA序列內(nèi)找尋PCR引物，需特別注意兩點(diǎn)：首先，盡力將引物和產(chǎn)物保持在mRNA的編碼區(qū)域內(nèi)，因?yàn)檫@是生成蛋白質(zhì)的獨(dú)特序列，不像3’末端非編碼區(qū)域與許多其他mRNA有同源性；第二，盡力把引物放在不同的外顯子上，以便使RNA特異的PCR產(chǎn)物與從污染DNA中產(chǎn)生的產(chǎn)物在大小上相區(qū)別。
若PCR的目的是克隆一個(gè)基因或cDNA的特異序列，產(chǎn)物的大小是根據(jù)具體應(yīng)用預(yù)選的。在這里，計(jì)算機(jī)程序可以提供關(guān)于期望區(qū)域側(cè)翼選擇引物對(duì)的信息。
在選擇用來(lái)擴(kuò)增來(lái)自不同物種DNA的引物時(shí)，應(yīng)避開(kāi)mRNA的5’和3’末端非翻譯區(qū)序列，因?yàn)樗鼈兛赡軟](méi)有任何的同源性。
3．簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)
①設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物時(shí)，一定要檢查靶擴(kuò)增區(qū)域選定氨基酸遺傳密碼的簡(jiǎn)并度。很顯然，我們期望選擇簡(jiǎn)并度最低的氨基酸，達(dá)到提高特異性的目的。
②充分注意物種對(duì)于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡(jiǎn)并性。
③應(yīng)努力避免3’末端的簡(jiǎn)并，對(duì)于大多數(shù)氨基酸殘基來(lái)說(shuō)，意味著引物3’末端不要位于密碼子的第三位。
④在一些多義位置使用脫氧次黃嘌呤（dI）代替簡(jiǎn)并堿基。
4． 測(cè)序引物設(shè)計(jì)
當(dāng)然，測(cè)序引物的設(shè)計(jì)一般都由測(cè)序公司來(lái)完成，如果需要自己設(shè)計(jì)的話；那么除了按照上面所提到的引物設(shè)計(jì)通用標(biāo)準(zhǔn)外，還需要注意兩點(diǎn)：
①測(cè)序引物的特異性的標(biāo)準(zhǔn)掌握應(yīng)該更嚴(yán)格一些，也就是說(shuō)設(shè)計(jì)時(shí)更優(yōu)先考慮特異性。因?yàn)樵跍y(cè)序反應(yīng)中，如果引物與模板在非預(yù)期位置退火并引發(fā)鏈延伸，會(huì)對(duì)結(jié)果對(duì)來(lái)很大的干擾甚至造成結(jié)果無(wú)法識(shí)讀。
②測(cè)序引物的Tm值適當(dāng)高一些�，F(xiàn)在大部分測(cè)序反應(yīng)均選用耐熱的測(cè)序級(jí)DNA聚合酶來(lái)催化，并采用PCR的熱循環(huán)程序。選用的測(cè)序引物的Tm值稍高一些，有助于使反應(yīng)順利跨過(guò)待測(cè)模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)，也有助于降低非特異反應(yīng)。
5． 探針的設(shè)計(jì)
探針的設(shè)計(jì)，根據(jù)不同的用途各有其設(shè)計(jì)特點(diǎn)，這里只是就通用的原則進(jìn)行討論：
①探針的長(zhǎng)短一般在20-50核苷酸之間，過(guò)長(zhǎng)合成成本高，且易出現(xiàn)聚合酶合成錯(cuò)誤，雜交時(shí)間長(zhǎng)。太短則特異性下降。
②注意G和C的含量努力控制在40-60％，同時(shí)一種堿基連續(xù)重復(fù)不超過(guò)4個(gè)，以免非特異性雜交產(chǎn)生。
③探針自身序列不能形成二聚體，也不能有“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)存在，這一點(diǎn)上的要求就要比普通引物設(shè)計(jì)嚴(yán)格得多。
④如果探針地靶目標(biāo)是多個(gè)基因的混合物，就必須控制該探針與無(wú)關(guān)基因之間的相似性在70%以下。
PCR中常見(jiàn)問(wèn)題分析與對(duì)策．
PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間
一般認(rèn)為PCR產(chǎn)物應(yīng)在48h以內(nèi)完成電泳檢測(cè)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型就會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則，甚至消失。
