一． 污染的預(yù)防
進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。
（一）劃分操作區(qū)：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作，但無論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：
1. 標(biāo)本處理區(qū)，包括擴(kuò)增摸板的制備；
2. PCR擴(kuò)增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增；
3. 產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。
各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標(biāo)本制備→PCR擴(kuò)增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。
切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。
（二）分裝試劑：PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來源的DNA：
1． PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水；
2． 引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制；
3． 引物和dNTP應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因。
(三) 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：
1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；
2. 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；
3. 避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度；
5. 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管；
6. 操作時(shí)設(shè)立陰陽性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性；
7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)；
8. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。
二． 追蹤污染源
如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。
（一）設(shè)立陰陽性對(duì)照：有利于監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽性對(duì)照時(shí)，應(yīng)選擇擴(kuò)增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強(qiáng)陽性對(duì)照可產(chǎn)生大量不必要的擴(kuò)增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對(duì)照，100個(gè)拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴(kuò)增。陰性對(duì)照的選擇亦要慎重，因?yàn)镻CR敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點(diǎn)雜交等）檢測(cè)陰性的標(biāo)本中檢測(cè)出極微量的靶分子。此外，每次擴(kuò)增均應(yīng)包括PCR體系中各試劑的時(shí)機(jī)對(duì)照，即包括PCR反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板DNA，這對(duì)監(jiān)測(cè)試劑中PCR產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴(kuò)增結(jié)果中試劑對(duì)照為陽性結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時(shí)，要全部更換一批新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)設(shè)立不同的反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測(cè)試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上處理。
（二）環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，如果預(yù)防措施比較嚴(yán)密，則考慮可能為環(huán)境污染。
環(huán)境污染中常見的污染源主要有：
1. 模板提取時(shí)真空抽干裝置；
2. 凝膠電泳加樣器；
3. 電泳裝置；
4. 紫外分析儀；
5. 切膠用刀或手術(shù)刀片；
6. 離心機(jī)；
7. 冰箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒?yàn)臺(tái)面等；
此時(shí)可用擦拭實(shí)驗(yàn)來查找可疑污染源。1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2）0.1ml去離子水浸泡；3）取5ml做PCR實(shí)驗(yàn)；4）電泳檢測(cè)結(jié)果。
8. 氣溶膠。如果經(jīng)過上述追蹤實(shí)驗(yàn)，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時(shí)就應(yīng)該更換實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，若條件不允許，則重新設(shè)計(jì)新的引物（與原引物無相關(guān)性）。
三．污染處理
（一）環(huán)境污染
1. 稀酸處理法：對(duì)可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤；
2. 紫外照射（UV）法：紫外波長(zhǎng)（nm）一般選擇254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時(shí)，要考慮PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照射僅對(duì)500bp以上長(zhǎng)片段有效，對(duì)短片段效果不大。UV照射時(shí)，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會(huì)形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長(zhǎng)，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點(diǎn)相鄰核苷酸的序列。在受照射的長(zhǎng)DNA鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA斷裂等）均可終止Taq DNA聚合酶的延伸。這些位點(diǎn)的數(shù)量與二聚體位點(diǎn)相當(dāng)。如果這些位點(diǎn)（0.13/堿基）在DNA分子上隨機(jī)分布，一個(gè)500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點(diǎn)，那么，105個(gè)這樣的分子中每個(gè)分子中會(huì)至少有一處損傷。相反，如果100bp的片段，每條鏈上僅有6處損傷，105個(gè)拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長(zhǎng)度限制的原因。
（二）反應(yīng)液污染
可采用下列方法之一處理：
1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室溫反應(yīng)30 min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要知道污染DNA的序列；
2. 內(nèi)切酶法：選擇識(shí)別4個(gè)堿基的內(nèi)切酶（如Msp I和Taq I等），可同時(shí)選擇幾種，以克服用一種酶只能識(shí)別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進(jìn)行PCR；
3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進(jìn)行紫外照射，注意事項(xiàng)與方法同上述UV照射法；
4. g射線輻射法：1.5kGy的輻射可完全破壞0.1ng基因組DNA，2.0 kGy可破壞104拷貝的質(zhì)粒分子，4.0 kGy仍不影響PCR，但高于此限度會(huì)使PCR擴(kuò)增效率下降。引物可受照射而不影響PCR，g射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來破壞DNA的。
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用對(duì)500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測(cè)的PCR擴(kuò)增片段通常為300bp左右，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。
1. 原理：在PCR產(chǎn)物或引物中用dU 代替dT。這種dU化的PCR產(chǎn)物與UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG對(duì)不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對(duì)RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。
2. dUTP法：用dUTP代替dTTP，使產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會(huì)影響含dU的新的PCR產(chǎn)物。
3. dU引物法：合成引物時(shí)以dU 代dT，這樣PCR產(chǎn)物中僅5ˊ端帶dU。UNG處理后，引物失去了結(jié)合位點(diǎn)而不能擴(kuò)增。對(duì)長(zhǎng)片段（1-2kb以上）的擴(kuò)增用dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點(diǎn)。dU引物最好將dU設(shè)計(jì)在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。
4. 優(yōu)點(diǎn)：可以去除任何來源的污染；UNG處理可以和PCR擴(kuò)增在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行；由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量dU存在，可徹底消除污染源。
5. 需注意的是摻入dUTP的DNA不應(yīng)對(duì)產(chǎn)物的任何操作有影響，在進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆時(shí)，應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會(huì)被受體菌UNG消化掉。
（四） 固相捕獲法
用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì)，原理如下：1）用一生物素標(biāo)記的單鏈RNA探針與待擴(kuò)核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴(kuò)增區(qū)；2）用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸，通過漂洗可去除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物和雜質(zhì)；3）洗脫靶分子后用特異引物擴(kuò)增非RNA探針雜交區(qū)域。第2）步的漂洗后可用PCR檢測(cè)以確定標(biāo)本是否被擴(kuò)增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。
（五）RS-PCR法（RNA-specific PCR）
也稱為鏈特異性PCR，主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的3ˊ端（A區(qū)）有2 0個(gè)核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端2 0個(gè)核苷酸（C區(qū)）為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使 cDNA與多余引物分開，再用和第二引物（C）以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，以后的PCR循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B區(qū)和引物C進(jìn)行擴(kuò)增加尾cDNA，而污染的DNA或質(zhì)粒DNA才不會(huì)被擴(kuò)增。
（六）抗污染引物法
該對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點(diǎn)。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中，在重組質(zhì)粒中，這一區(qū)域分成兩個(gè)區(qū)域與克隆位點(diǎn)被。如果重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本，也不能擴(kuò)增出任何條帶，即使出現(xiàn)了擴(kuò)增帶，其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴(kuò)增，因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增帶就可以證明標(biāo)本是陽性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。
四．其它PCR檢測(cè)方法：
（一） 兩步法：是指在用套式PCR方法擴(kuò)增某些含量低微的標(biāo)本時(shí)，兩對(duì)引物在同一個(gè)管中以簡(jiǎn)化步驟，減少污染。通常第一步進(jìn)行20-25個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增外引物片段；第二步再進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增內(nèi)引物片段。兩步法對(duì)內(nèi)外引物的Tm值有特殊要求，即內(nèi)外引物的退火溫度高（如68℃），在此溫度下內(nèi)引物不與模板退火，然后降低退火溫度（至55℃）再擴(kuò)增內(nèi)引物片段，這樣，在操作過程中，僅打開PCR反應(yīng)管一次，大大減少了污染的可能性。
（二） 熒光法：亦稱熒光PCR技術(shù)（fluoresence PCR, F-PCR），是1995年由美國PE公司首先研制成功的，它融匯了PCR的靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點(diǎn)，電腦同步跟蹤，數(shù)據(jù)自動(dòng)化處理，直接探測(cè)PCR過程中的變化以獲得定量的結(jié)果，不需要做PCR后處理或檢測(cè)，完全閉管操作。探針標(biāo)記除用TET和FAM外，還可用HEX、JOE作為報(bào)告熒光，3′端的淬滅基團(tuán)常用TAMRA。在探針保持完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光被熒光抑制基團(tuán)淬滅，而在探針被切斷后，熒光報(bào)告基團(tuán)才發(fā)出報(bào)告熒光，且熒光的強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正比。熒光檢測(cè)儀器透過PCR管壁能直接檢測(cè)到熒光信號(hào)的波長(zhǎng)和長(zhǎng)度變化。
主要有以下優(yōu)點(diǎn)：
1.探針特異性強(qiáng)，假陽性率低；
2.操作快速，不需要PCR后處理；
3.定量范圍寬，HBV 0.4fg-4000fg/ml(102-106 Dane′s particle/ml)；
4.閉管操作，PCR產(chǎn)物污染少；
5.靈敏度高。
主要方法有：
1..熒光探針法：進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)時(shí)，要求熒光探針必須完全與靶基因互補(bǔ)，長(zhǎng)度以20-30個(gè)堿基為宜，必要時(shí)3′端磷酸化封閉，以防在擴(kuò)增時(shí)作為引物延伸。該方法利用Taq酶的3′→5′聚合酶活性及5′→3′外切酶活性，可以在鏈延伸過程中實(shí)現(xiàn)鏈替換，并將被替換的探針切斷，故可進(jìn)行定性與定量檢測(cè)。
熒光探針5′端標(biāo)記的TAMRA，在480nm激發(fā)下產(chǎn)生530nm的紅色熒光；3′端標(biāo)記的FAM，激發(fā)后產(chǎn)生綠色熒光。PE公司推出的TaqMan系統(tǒng)，即采用雙熒光探針，如配合使用PCR擴(kuò)增與熒光檢測(cè)合二為一的儀器，可進(jìn)行實(shí)時(shí)（real-time）定量檢測(cè)。
2．分子信標(biāo)法：分子信標(biāo)（molecular beacon）是一個(gè)發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的特異探針，其環(huán)狀部分與靶序列互補(bǔ)。在室溫時(shí)，分子信標(biāo)的發(fā)夾緊閉，熒光淬滅。PCR擴(kuò)增時(shí)，隨著溫度升高，發(fā)夾松開，與單鏈模板特異結(jié)合，發(fā)出熒光。熒光強(qiáng)度與模板呈正比，故可用于PCR產(chǎn)物的定性及定量。
