將樣品在電泳前標記Cy2、Cy3 和Cy5 這3 種熒光染料,然后將標記后的3 種樣品混合, 同時在一塊膠上進行電泳,即為差異凝膠電泳(DIGE) 。所得到的2D 膠圖像可使用3 種不同的激發(fā)P發(fā)射過濾器得到不同顏色熒光信號,根據(jù)這些信號的比例來判斷樣品之間蛋白質的差異,這樣可避免在匹配時出現(xiàn)的誤差,進行定量分析時也不依賴于膠與膠之間的重復性。用于標記的熒光基團在化學結構上相似,分子量也基本相同,都帶有正電荷,所以在與賴氨酸殘基反應時,保證了所有的樣品可以移至相同的位置。該方法的靈敏度可與銀染和SYPRO Ruby 相媲美, 可檢測到100～200pg 的蛋白質,線形動態(tài)范圍在5 倍左右。已有很多文獻證明該方法的靈敏性和重復性,如用該方法研究苯甲酸對大腸桿菌的抑制作用和食道癌的特征蛋白。該方法也提高了定量上的準確性。由于實驗方法本身造成的蛋白質斑點強度的差異,比如樣品在進入膠條時會有一些樣品損失,但在同一塊差異凝膠電泳膠上就不會出現(xiàn)這樣的差異。目前出現(xiàn)了一種改良了的DIGE 技術使其更好的進行定量分析, 該技術將Cy2 作為用Cy3、Cy5 標記的蛋白質內標, 用以比較數(shù)據(jù)庫中各個膠之間的蛋白質的量的差異。DIGE 可在同一次檢測中通過分析單一膠上的相互覆蓋的信息來得到蛋白質的信息,可以同時在一塊膠上在相同電泳條件下分離2～3 個樣品,大大減少了一個實驗需要的膠的總數(shù) 。
雖然從理論上來說,該方法非常誘人, 但DIGE 本身還有很多技術上的問題。如:1) 只有當約1 %～2 %的蛋白質的賴氨酸殘基在熒光標記時修飾,才可以維持被標記的蛋白在電泳時的溶解性;2) 在DIGE 染色中丟失的蛋白質基本確定為樣品中的低豐度蛋白; 3) 雖然經染色后在電荷上未發(fā)生變化,被染料標記的蛋白質比未標記的蛋白質點向大分子方向有輕微遷移,主要是由于熒光團的加入。這使得在標記的和未標記蛋白之間產生95 %的誤差, 之后在質譜分析時產生更多的復雜問題�？赏ㄟ^再染色的方法以使割點的步驟不出錯。但考馬斯亮藍染色比DIGE 染色方法靈敏度低,有約40 %的興趣蛋白質點不能從考馬斯亮藍染色的膠上被發(fā)現(xiàn)。因此,高靈敏度的染色方法SYPRO Ruby 被用于作為DIGE 后染色的方法。4) 另一個值得注意的影響靈敏度的問題是熒光物質在激發(fā)P發(fā)射過程中會出現(xiàn)信號的相互干擾。引發(fā)Cy3 的激發(fā)波長有時可引起Cy5 標記的蛋白發(fā)射。
雖然從理論上來說,該方法非常誘人, 但DIGE 本身還有很多技術上的問題。如:1) 只有當約1 %～2 %的蛋白質的賴氨酸殘基在熒光標記時修飾,才可以維持被標記的蛋白在電泳時的溶解性;2) 在DIGE 染色中丟失的蛋白質基本確定為樣品中的低豐度蛋白; 3) 雖然經染色后在電荷上未發(fā)生變化,被染料標記的蛋白質比未標記的蛋白質點向大分子方向有輕微遷移,主要是由于熒光團的加入。這使得在標記的和未標記蛋白之間產生95 %的誤差, 之后在質譜分析時產生更多的復雜問題�？赏ㄟ^再染色的方法以使割點的步驟不出錯。但考馬斯亮藍染色比DIGE 染色方法靈敏度低,有約40 %的興趣蛋白質點不能從考馬斯亮藍染色的膠上被發(fā)現(xiàn)。因此,高靈敏度的染色方法SYPRO Ruby 被用于作為DIGE 后染色的方法。4) 另一個值得注意的影響靈敏度的問題是熒光物質在激發(fā)P發(fā)射過程中會出現(xiàn)信號的相互干擾。引發(fā)Cy3 的激發(fā)波長有時可引起Cy5 標記的蛋白發(fā)射。
