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固相膜核酸分子雜交方法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01

1.DNA的變性解鏈是雜交成功的關(guān)鍵,Southern印跡雜交時DNA在凝膠中變性,變性方法是將凝膠浸在數(shù)倍體積的1.5mol/L
NaCl和0.5mol/L NaOH中1小時,然后用數(shù)倍體積的1mol/L Tris-HCl (pH8.0)和1.5mol/L NaCl溶液中和1小時。DNA受酸、堿、熱等處理均能發(fā)生變性,但強酸會使核酸降解。堿變性可避免DNA的降解、熱變性要在低DNA濃度(100μg/ml)和低鹽濃度(0.1 SSC 15mmol/L NaOH,1.5mmol/L檸檬酸三鈉,pH7.0)下進行。用SSC稀釋DNA溶液為50μg/ml,加10mol/L NaOH使最終濃度為0.1mol/L(pH約12.8),室溫變性10min,很快置冰鹽水中,用10mol/L HC1或5mol/L NaH2PO4調(diào)pH到7-8(亦可用堿變性后,調(diào)至中性,再加熱100℃后,調(diào)至中性,或只加熱100℃10min)。DNA變性可用OD260增加(約30-40%)來檢測,變性DNA醇沉淀呈雪樣,完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC,冰溶保存。

2.變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定。硝酸纖維素濾膜(孔徑0.45um)先在蒸餾水中充分浸泡,再用6SSC浸泡30min~2h,涼干,DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后,先室溫干燥4h,然后再在80℃真空干燥2h。

3.預(yù)雜交。濕潤的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中,按每平方厘米膜加0.2ml預(yù)熱至60℃的預(yù)雜交液(6×SSC,0.5%SDS,5×Denhardt液,100μg/ml鮭魚精DNA)。鮭魚精DNA需經(jīng)過剪切和DNA酶消化處理,然后酒精沉淀純化,調(diào)濃度至10μg/ml,用前放100℃水溶液中煮沸變性10min,冰水驟冷。盡可能將袋中氣泡趕盡,用封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68℃水浴中保溫3-12h,當預(yù)雜交液溫度升至68℃時,在濾膜表面常會形成水氣泡,輕輕晃動袋中液體即可除去這些小氣泡,這一點對于保證濾膜表面充分浸潤預(yù)雜交液很重要。

4.雜交。
從水浴中取出塑料袋,用剪刀剪開一角,盡可能擠凈預(yù)雜交液,用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中,用恰好足量的液體保持濾膜濕潤(50ul/cm2)。溶液的組成是6×SSC,0.01mol/L EDTA,變性的標記核酸探針,5×Denhardt液,0.5%SDS,100mg/ml變性的鮭魚精DNA。盡可能趕盡氣泡后,將塑料袋嚴密封口。雜交反應(yīng)在68℃水浴中進行,所需時間視探針和檢測靶DNA的性質(zhì)及探針的比活性等情況而定,一般為4-20h。

5.洗膜。取出塑料袋,用剪刀剪開,小心取出濾膜,立即浸入盛有2×SSC和0.5%
SDS溶液的盤中,室溫下漂洗5min,再將濾膜移入2×SSC和0.1%
SDS中,室溫下洗滌15分鐘(輕輕搖動),然后將濾膜移入0.1%×SSC和0.5%×SDS溶液中,68℃輕輕搖動保溫2h,更換緩沖液后繼續(xù)保溫30min。 洗脫的溫度一般應(yīng)控制在Tm值12℃以下,[Tm=69.3 0.41×(G C)%],雙鏈DNA的Tm值隨錯配堿基對數(shù)每增加1%而遞減1℃。

6.結(jié)果顯示。放射性測定方法,固相膜的放射性雜交結(jié)果顯示有兩種方式,一是放射自顯影法、另一是液閃計數(shù)法,放射自顯影法比較簡單,只需將雜交膜與X光片在暗盒中暴光數(shù)小時至數(shù)天,再顯影,定影即可。對于雜交信號較強的固相膜,用一塊增敏屏可顯著增強暴光強度。此外,為了減弱32P的放射,暴光通常在-20℃或-
80℃下進行。液閃計數(shù)法主要用于斑點和狹縫雜交及為了比較兩個雜交信號的強弱等情形,方法是將完成雜交的膜在漂洗結(jié)束后剪成小塊(每份樣品1塊),80℃真空干燥后裝閃爍瓶,加入2—5 ml閃爍液,剪2-3塊無樣品作為本底對照,在液體閃爍計數(shù)器上自動計數(shù),液體計數(shù)測定放射性強度也可以在放射自顯影之后進行。

 
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