先找到需要設(shè)計(jì)引物的目標(biāo)基因的在有引物序列的mRNA序列,可以通過(guò)全文(如最先發(fā)現(xiàn)該基因的文章),全文中有時(shí)可以找到大鼠c-jun mRNA序列的ACCESSION NUMBER,在PubMed中的“Nucleotide”中用此ACCESSION NUMBER就能找到序列?梢岳眠@個(gè)ACCESSION NUMBER在PubMed中的“Nucleotide”中搜索到序列后,點(diǎn)擊右邊的“Links”,再點(diǎn)擊里面的“Related Sequences”就能找到所有的大鼠c-jun mRNA序列及其他物種的一些c-jun mRNA序列。
文獻(xiàn)中的引物最好先驗(yàn)證其序列正確,并用軟件分析引物比較好后再采用。通過(guò)BLAST驗(yàn)證,既可知道序列是否正確,也可同時(shí)了解引物的特異性、引物的位置及PCR產(chǎn)物的大小等。
如果僅僅是為了驗(yàn)證引物序列是否正確(僅適合于基于完全匹配原則設(shè)計(jì)的引物),也可以用Blast的“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”搜索,具體方法為:
1. 打開Blast,點(diǎn)擊“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”
2. 等新頁(yè)面完全顯示后,將引物序列直接copy到“Search”框(沒(méi)有必要將下游引物序列轉(zhuǎn)換成其互補(bǔ)鏈),下面3種方法都可以(我覺(jué)得這3種方法的搜索結(jié)果沒(méi)有什么區(qū)別,沒(méi)仔細(xì)比較過(guò)哦。
。ǎ保┲苯涌截惿嫌我镄蛄,然后直接將下游引物序列拷貝在上游引物后面
。ǎ玻┲苯涌截惿嫌我镄蛄校谏嫌我镄蛄泻蠹右豢崭,然后直接將下游引物序列拷貝在空格后面
。ǎ常┲苯涌截惿嫌我镄蛄校瑩Q行,然后直接拷貝下游引物序列
注意:記住上、下游引物的長(zhǎng)度,如上游引物為19bp、下游引物為18bp,這在查看Blast結(jié)果時(shí)有用。
3. 點(diǎn)擊“BLAST!”,新頁(yè)面完全出來(lái)以后,點(diǎn)擊“Format!”。
4. 結(jié)果完全出來(lái)后,查找有沒(méi)有和1-19、20-37同時(shí)完全匹配的基因,其他的就不用考慮了。當(dāng)然,如果下游引物序列所對(duì)應(yīng)的基因片段的3'端正好和上游引物序列的3'端的1或2個(gè)堿基互補(bǔ),那就可能是19-37或18-37。
如果有,那你的引物序列就是正確的。從文獻(xiàn)上查的引物,除了要用Blast驗(yàn)證其序列是否正確外,還是應(yīng)該用軟件分析分析到底引物好不好。