用第一套引物擴(kuò)增15~30個(gè)循環(huán),再用擴(kuò)增DNA片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增15~30個(gè)循環(huán),這樣可使待擴(kuò)增序列得到高效擴(kuò)增,而次級(jí)結(jié)構(gòu)卻很少擴(kuò)增。用起始引物限量方法或Centricon30(Amicon)分子濾過(guò)器離心,在第二套引物加入前去除第一引物。此方法已成功地用來(lái)分析中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞AS52的分子突變。AS52細(xì)胞含有單拷貝的細(xì)胞gpt(guanine phos-phribosy transferase)基因,與哺乳動(dòng)物具有同源性。套式引物PCR減少了引物非特異性退火,從而增加了特異性擴(kuò)增,提高了擴(kuò)增效率。對(duì)環(huán)境樣品中微生物檢測(cè)和單拷貝的基因靶DNA的擴(kuò)增是非常有效的。
若將套式PCR的內(nèi)外引物稍加改變,延長(zhǎng)外引物長(zhǎng)度(至25~30bp),同進(jìn)縮短內(nèi)引物長(zhǎng)度(15~17bp),使外引物先在高溫退火溫度下做雙溫循環(huán)擴(kuò)增,然后改換至三溫循環(huán),使內(nèi)引物在外引物擴(kuò)增的基礎(chǔ)上作低溫火溫度的三溫循環(huán)直到擴(kuò)增完成,這樣就可以使兩套引物一次同時(shí)加入,兩種循環(huán)一氣呵成,等于只做一次PCR,而靈敏度與套式二次PCR無(wú)異,在我們最近推出的PTc 51氣流式DNA熱循環(huán)儀上就可以完成全部程序。
套式一次PCR的成功,使PCR檢測(cè)的全過(guò)程可以在5h內(nèi)完成,使當(dāng)天出檢驗(yàn)報(bào)告成為現(xiàn)實(shí),也使PCR檢測(cè)走入臨床有了現(xiàn)實(shí)的基礎(chǔ)。