如何設(shè)計(jì)有效的siRNA一直是當(dāng)前RNAi研究的熱點(diǎn)話題.基因抑制的有效性很大程度取決于目的基因序列的選擇。目的序列可以隨機(jī)選擇也可以通過(guò)在目的基因的不同區(qū)域上測(cè)試不同的序列以決定何種序列是最有效的。以下所述幾條對(duì)于siRNA設(shè)計(jì)的成功極為重要。
1. 從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開(kāi)始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。正義鏈和反義鏈都采用這19個(gè)堿基(不包括AA重復(fù))來(lái)設(shè)計(jì)。
2.避免在起始密碼子或無(wú)義區(qū)域附近選擇目的序列。
3.SiRNA序列的GC含量應(yīng)為30%-50%左右。
4. Tuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對(duì)5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。
5. 將挑選的序列在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比較以確保目的序列與其它基因沒(méi)有同源性。
6.將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST
7.選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
8.負(fù)對(duì)照:一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有負(fù)對(duì)照，作為負(fù)對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒(méi)有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒(méi)有同源性。
如果計(jì)劃合成siRNA，那么可以直接提供以AA打頭的21個(gè)堿基序列，廠家會(huì)合成一對(duì)互補(bǔ)的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3'dTdT結(jié)尾，如果要UU結(jié)尾的話通常要特別說(shuō)明。有結(jié)果顯示，UU結(jié)尾和dTdT結(jié)尾的siRNA在效果上沒(méi)有區(qū)別。因?yàn)檫@個(gè)突出端無(wú)需和靶序列互補(bǔ)。
