增殖型腺病毒系統(tǒng)又稱為腫瘤特異性增殖型腺病毒，多用于腫瘤的基因治療。該載體利用腫瘤與正常組織及細(xì)胞間結(jié)構(gòu)或代謝途徑上的差異，使病毒可以特異性地靶向腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、增殖，大量表達(dá)目的基因并最終裂解腫瘤細(xì)胞。以增殖型腺病毒載體作為腫瘤生物治療的平臺(tái)，可以充分利用腺病毒體積較小、彌散能力強(qiáng)的特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的復(fù)制缺陷型腺病毒載體比較有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：病毒的大量增殖可以直接殺死感染的腫瘤細(xì)胞，并擴(kuò)散到鄰近腫瘤細(xì)胞；腺病毒溶解腫瘤細(xì)胞能釋放腫瘤抗原，提呈給樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞識(shí)別，起到"瘤苗"的作用，產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)；除了自身的溶腫瘤能力，增殖型腺病毒載體在大量復(fù)制增殖的同時(shí)還可使所攜帶的外源基因大量表達(dá)，通過(guò)多種途徑殺滅腫瘤。與傳統(tǒng)的腫瘤基因治療以及化療方案不同，以增殖型腺病毒載體攜帶抗癌基因治療腫瘤過(guò)程中所表達(dá)的抗癌活性物質(zhì)不但不會(huì)因藥物半衰期而減少，從理論上講，只要腫瘤細(xì)胞存在，抗癌活性物質(zhì)就會(huì)表達(dá)，直至殺滅全部的腫瘤細(xì)胞。對(duì)于增殖型腺病毒載體來(lái)說(shuō)，最重要的莫過(guò)于安全性的問(wèn)題，也就是如何使其識(shí)別何者為腫瘤細(xì)胞，何者為正常細(xì)胞，換言之，就是靶向性的問(wèn)題。大體上，增殖型腺病毒載體的靶向性是通過(guò)以下三種策略實(shí)現(xiàn)的：
1) 基因缺失突變
我們知道，細(xì)胞被病毒感染后的許多表現(xiàn)與細(xì)胞在發(fā)生癌變時(shí)出現(xiàn)的變化極其相似（如，p53腫瘤抑制蛋白的失活等）。這就使利用基因敲除的方法使病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)有選擇性地復(fù)制增殖成為可能。目前在這方面的研究可以分為兩個(gè)發(fā)展方向：大段的基因敲除和有選擇性地敲除腺病毒有效復(fù)制所必須且（或者）對(duì)正常細(xì)胞有毒性但在腫瘤細(xì)胞中卻不需要的基因。前者中比較有代表性的是E1B-55kD區(qū)敲除的ONYX-015（又名dl1520，CI1042）。Bischoff JR教授認(rèn)為：腺病毒在其生活周期中早期表達(dá)的蛋白E1A可以激活宿主細(xì)胞的p53途徑使細(xì)胞凋亡，E1B-55KDa蛋白可以阻斷該途徑，使腺病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)完成完整的生活周期。因此，E1B-55kDa缺失的腺病毒感染p53功能正常的細(xì)胞后，其E1A激活宿主細(xì)胞的p53途徑，該細(xì)胞將發(fā)生凋亡，病毒不能有效復(fù)制。而在p53功能異常的細(xì)胞（50%左右腫瘤細(xì)胞的p53功能異常）內(nèi)則可以復(fù)制增殖并最終將其裂解。雖然，ONYX-015溶瘤的確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步的商榷，但在已結(jié)束的II期臨床試驗(yàn)中，用ONYX-015聯(lián)合常規(guī)化療治療頭頸部腫瘤，顯示出良好的抗腫瘤能力（總有效率63%，為迄今最有效的腫瘤生物治療的臨床報(bào)告之一）。與dl1520這種大段的基因敲除不同，增殖型腺病毒Δ24及dl922-947作為有選擇性的基因敲除的代表，缺失的是腺病毒基因組中單一的保守區(qū)E1A CR2(E1A conserved region 2)，而對(duì)于其他有功能的部分并未觸及，因此這兩種病毒具有更好的靶向性，即pRb功能異常的細(xì)胞系（與p53途徑一樣，大多數(shù)的人類腫瘤細(xì)胞有pRb功能丟失的現(xiàn)象）；如果將野生型的pRb轉(zhuǎn)導(dǎo)到Rb-的腫瘤細(xì)胞株內(nèi)，則Δ24和dl922-947復(fù)制明顯受到抑制。無(wú)論是在體內(nèi)還是在體外實(shí)驗(yàn)中，dl922-947的殺傷能力都明顯強(qiáng)于dl1520。在人類腫瘤的裸鼠移植模型上，經(jīng)靜脈途徑給予dl922-947更是獲得了甚至超過(guò)野生型腺病毒的治療效果。
2) 利用組織/腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控病毒的復(fù)制
許多腫瘤組織特異性啟動(dòng)子已被人類所認(rèn)識(shí)，可將其分為三類：①針對(duì)所有腫瘤特征的啟動(dòng)子，如缺氧啟動(dòng)子、端粒酶啟動(dòng)子等；②針對(duì)個(gè)別腫瘤特征的啟動(dòng)子，如肝癌的甲胎蛋白（AFP）啟動(dòng)子、胃腸道腫瘤的癌胚抗原(CEA)啟動(dòng)子以及乳腺癌和卵巢癌的DF3/MUC-1啟動(dòng)子等；③針對(duì)某一類組織（必需不是至關(guān)重要的組織）特征的啟動(dòng)子，如前列腺特異性抗原（PSA）啟動(dòng)子等。將組織/腫瘤特異性啟動(dòng)子插入到病毒增殖必需基因的上游，可以在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)病毒復(fù)制進(jìn)行調(diào)控，使病毒靶向特定的組織。這一類病毒又被稱為臨時(shí)性增殖型病毒（provisionally replicating virus）近年來(lái)，對(duì)這方面的研究發(fā)展很快，幾乎涉及到迄今發(fā)現(xiàn)的每種啟動(dòng)子。但研究發(fā)現(xiàn)，不同的啟動(dòng)子之間在特異性和對(duì)腫瘤/組織及病毒基因的調(diào)控活力方面參差不齊，因此在選擇時(shí)應(yīng)當(dāng)慎重。比如AFP啟動(dòng)子和DF3/MUC-1啟動(dòng)子調(diào)控的臨時(shí)性增殖型腺病毒分別被用于對(duì)肝細(xì)胞癌和表達(dá)MUC-1的乳腺癌的研究，均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗腫瘤活性，相反用E2F啟動(dòng)子/增強(qiáng)子對(duì)E1A進(jìn)行調(diào)控卻表現(xiàn)除出多種細(xì)胞和組織的靶向作用。應(yīng)用這一策略最成功的例子來(lái)自美國(guó)的Calydon制藥公司的CN 706。1997年，Rodriguez R等人將人類PSA基因的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子成功插入到5型腺病毒E1A區(qū)的上游，并將其命名為CN706，這種通過(guò)PSA啟動(dòng)子/增強(qiáng)子調(diào)控的臨時(shí)性增殖性腺病毒，在LNCaP（一種經(jīng)修飾的可產(chǎn)生PSA的細(xì)胞株）內(nèi)可以復(fù)制增殖，并高水平地表達(dá)E1A，而在DU145（不產(chǎn)生PSA的人前列腺細(xì)胞株）內(nèi)不增殖。對(duì)裸鼠移植瘤模型進(jìn)行一次CN706瘤內(nèi)注射后即不再有PSA產(chǎn)生。目前該病毒已進(jìn)入對(duì)局部復(fù)發(fā)的前列腺癌患者的I期臨床試驗(yàn)。這種策略中有一個(gè)較大的弱點(diǎn)，即真核細(xì)胞的啟動(dòng)子并不能在病毒的基因組中嚴(yán)格地控制轉(zhuǎn)錄，而只需有少量的病毒產(chǎn)物（如，E1A）就足以滿足病毒增殖的需要，這就無(wú)法達(dá)到特異性的目的。研究表明，將啟動(dòng)子與病毒的基因組DNA隔絕開(kāi)來(lái)是解決這個(gè)問(wèn)題的一個(gè)好方法。有人嘗試將經(jīng)過(guò)改造的帶有特異性啟動(dòng)子的病毒基因調(diào)控盒子裝入一個(gè)質(zhì)粒載體中與轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，因?yàn)樵撦d體只表達(dá)一次，病毒也就只能進(jìn)行一輪復(fù)制。另外，用組織特異性啟動(dòng)子對(duì)兩個(gè)（或更多）病毒復(fù)制必需基因進(jìn)行調(diào)控，也是一種有效途徑。比如，CN706第二代產(chǎn)品CV787，就是用兩個(gè)PSA啟動(dòng)子/增強(qiáng)子分別控制腺病毒的E1A和E1B區(qū)，具有比CN706更好的靶向功能，目前也已經(jīng)進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)。
3) 對(duì)病毒外殼蛋白進(jìn)行改造
腺病毒的感染過(guò)程包括三個(gè)貫序發(fā)生卻又截然分開(kāi)的過(guò)程，即粘附、內(nèi)化和入核。任何一種成功的提高腺病毒載體靶向性的改造都應(yīng)以不影響腺病毒的這三個(gè)過(guò)程為原則。腺病毒的粘附和內(nèi)化過(guò)程分別與細(xì)胞表面的柯薩奇-腺病毒受體（CAR）和腺病毒五鄰體表面的RGD小肽（精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸）有關(guān)。前者與腺病毒纖維蛋白的頭部結(jié)合介導(dǎo)粘附過(guò)程，后者與細(xì)胞的整合素受體相互作用介導(dǎo)內(nèi)化�；谝陨系恼J(rèn)識(shí)，人們?cè)O(shè)想通過(guò)對(duì)腺病毒外殼蛋白改造以提高其靶向性，這個(gè)過(guò)程又稱為重新定靶（retargeting）。主要有以下幾種方法：
① 應(yīng)用雙特異性抗體 該方案的思路是：構(gòu)建一個(gè)雙特異性抗體，其一端是針對(duì)腺病毒頭部的單克隆抗體，另一端是一個(gè)可以與所靶向的腫瘤細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合的配體。FGF2（成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子）受體在包括膠質(zhì)瘤、卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的表面有過(guò)度表達(dá)，因此構(gòu)建兩端分別為抗腺病毒頭部單抗和FGF2的雙特異性抗體可以使腺病毒靶向這些腫瘤細(xì)胞。這種治療方案目前被用于對(duì)Kaposi肉瘤和卵巢癌的治療，并正在進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)。同樣的方法也適用于在膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞表面高水平表達(dá)的EGFR（表皮生長(zhǎng)因子受體）。Watkins等人構(gòu)建了一種EGF與抗腺病毒纖維結(jié)構(gòu)但鏈抗體的融合蛋白用于膠質(zhì)瘤的治療。這種方法的不足之處在于：由于抗腺病毒頭部的單抗與頭部之間是通過(guò)非共價(jià)連接，靜脈給藥時(shí)很容易脫離。
② 對(duì)腺病毒纖維結(jié)構(gòu)（或五鄰體亞單位）的修飾 這種方法是對(duì)上一方法的改良，其策略是對(duì)腺病毒的纖維結(jié)構(gòu)直接進(jìn)行修飾，使其可以與腫瘤細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合。但進(jìn)行這種改造時(shí)需要注意兩點(diǎn)問(wèn)題：首先，腺病毒的纖維結(jié)構(gòu)是以三聚體的形式存在的，任何形式的修飾都應(yīng)以不影響這種三聚體為原則；其次，經(jīng)過(guò)修飾的纖維蛋白等同于配體，它應(yīng)該能夠被腫瘤細(xì)胞表面的特異性受體識(shí)別并與之結(jié)合。Dmitriev等人將FLAG肽插入HI環(huán)，發(fā)現(xiàn)不會(huì)影響腺病毒存活和增殖。其后他們將RGD-4C肽插入HI環(huán)，構(gòu)成腺病毒載體AdRGD，該病毒可通過(guò)插入肽RGD-4C識(shí)別特異性受體，使AdRGD與靶細(xì)胞特異性地相互作用。由此獲得非CAR依賴性腺病毒，使許多CAR陰性的腫瘤細(xì)胞系腺病毒感染率大幅度提高，這些腫瘤包括卵巢癌、胰腺癌、膽管癌、結(jié)腸癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌。
