差異消減展示

差異消減展示(differential subtraction display,DSD)是1998年Jose等針對差異展示的缺點而提出的改進方法。此法可顯著降低假陽性，增強重復(fù)性及敏感性，同時保持了對輕度、中等程度改變的(up- or down-regulation)RNA的識別。它的最大改進是：在DDRT-PCR呈現(xiàn)出差異條帶之后，克隆差異條帶之前，先對PCR擴增產(chǎn)物進行消減雜交，即在回收目的方差異條帶的同時，回收對照方相應(yīng)范圍的條帶�；厥盏牟町悧l帶用非生物素標(biāo)記的引物與dNTP進行PCR擴增，而對照方回收的產(chǎn)物用含生物素標(biāo)記的dATP的dNTP進行PCR擴增，其PCR產(chǎn)物進行消減雜交，用鏈親和素-生物素磁珠分離系統(tǒng)去除雜交產(chǎn)物，剩下的產(chǎn)物由帶有α-32P dATP的dNTP進行擴增，可重復(fù)差異展示，增加差異條帶的特異性。實驗證明，消減雜交使得輕度、中等程度改變的差異表達基因都能夠保留下來，而假陽性產(chǎn)物被去除。其它方面的改進是：① 使用標(biāo)準(zhǔn)的oligo (dT)起始mRNA(不用總RNA)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。② 重復(fù)性好的雙引物擴增所需的cDNA范圍很小，摸索合適的cDNA量對重復(fù)性很重要。③ 錨定引物具有擴增優(yōu)勢，為了克服這種優(yōu)勢，增加隨機引物的濃度后發(fā)現(xiàn)，隨著隨機引物濃度的增加，呈現(xiàn)出的條帶數(shù)顯著減少，這就是引物相互干擾，其原因可能有二：一方面5′端10bp的隨機引物不受mRNA 3′端限制，只是提供總的擴增容量；另一方面，mRNA 3′端非翻譯區(qū)包含AT富集區(qū)，使得錨定引物更易結(jié)合mRNA 3′端。因此，設(shè)計新的增強特異性及靈敏性的錨定引物更加必要。實驗證實，使用T12VNN(V=A、C or G;N=A、C、G or T)錨定引物比常規(guī)的T12VN錨定引物能呈現(xiàn)出更大量的差異條帶，而且具有更強的特異性及靈敏性，T12AA、T12AT、T12CT、T12GT不能產(chǎn)生清晰的差異條帶，只能出現(xiàn)smear現(xiàn)象，應(yīng)避免使用。④ 循環(huán)次數(shù)太多，引物消耗完后常導(dǎo)致高分子量smear現(xiàn)象。這主要原因是：PCR產(chǎn)物的3′-OH端相互退火，導(dǎo)致PCR循環(huán)期間產(chǎn)物末端被延伸或隨意終止，因此摸索最佳循環(huán)次數(shù)及退火溫度對消除假陽性更具有意義。此技術(shù)最大的優(yōu)勢是獲得的差異條帶在RNA印跡上重現(xiàn)性好，保持了中等程度改變的差異表達基因的呈現(xiàn)與克隆。特別是長距離PCR擴增技術(shù)的運用，使得此技術(shù)有可能成為目前篩選差異表達基因最有效的技術(shù)。它的唯一不足是步驟繁瑣、工作量大。