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聚合酶鏈反應技術

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

聚合酶鏈反應技術簡稱PCR技術,是一種利用DNA變性和復性原理在體外進行特定的DNA片斷高效擴增的技術,可檢出微量靶序列(甚至少到1個拷貝)。在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。僅需用極少量模板,在一對引物介導下,在數(shù)小時 內可擴增至100萬-200萬份拷貝。PCR反應分三步:變性、退火及延伸。以上三步為一循環(huán),每一循環(huán)的產物作為下一個的模板,這樣經過九小時的循環(huán),每一循環(huán)的產物作為下一個循環(huán)的模板,這樣經過數(shù)上時的循環(huán)后,可得到大量復制的特異性DNA片段。反應條件一般為94℃變性30秒,55℃退火30秒,70-72℃延伸30-60秒,共進行30次循環(huán)左右,最后再延伸72℃5分鐘,4℃冷卻終止反應。

1.逆轉錄PCR(RT-PCR)用來擴增RNA的方法。

2.競爭逆轉錄PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低豐度RNA定量的好方法。

3.多重PCR(multiples PCR)在同一PCR體系中加入多對引物可用于基天長度很長,發(fā)生多處缺失的???

4.多種PCR可同時加入多套以生物素標記的引物起進手PCR反應。

5.反向PCR(iverse polymerase chain reaction)對一個已知的DNA片段兩側的未知序列進行擴增和研究。

6.不對稱PCR在擴增循環(huán)中引入不同引物濃度,以得到單鏈DNA并進行列測定,以了解目的基因的序列。

7.錨定PCR(anchored polymerase chain reaction)幫助克服序列未知或序列未全知帶來的障礙。在未知序列未端添加同聚物尾序,將互補的引物連接于一段帶限制性內切酶位點的錨上,在錨引物和基因另一側特異性引物的作用下,將未知序列擴增出來。

8.著色互補試驗或熒光PCR(color complementation assay or fluorescent PCR)原理是用不同熒光染粒,分別標記于不同寡核苷酸引物上,同時擴增多個DNA片段,反應完畢后,利用分子篩選去多余的引物。用紫外線照射擴增產物,就能顯示某一DNA區(qū)帶熒光染料顏色的組合,如果某一DNA區(qū)帶熒光染色料顏色的組合,如果某一DNA區(qū)帶缺失,則會缺乏相應的顏色。

9.雙溫PCR(two-temperature PCR)僅僅執(zhí)行兩步溫度程序。合并退火與延伸溫度。一般常用溫度是94-95℃和46-47℃?梢蕴岣叻磻乃俣群吞禺愋。

上述這些PCR技術的應用:(1)PCR技術擴增特定序列為基礎,采用多種方法進行檢測,如PCR-RFLP、PCR-SSCP從已克隆的雙鏈DNA中產生特異性序列作為分子探針;(2)通過選擇性擴增cDNA中產生特異性序列作為分子探針;(2)通過選擇性擴增cDNA中的特殊片段,產生針對尚未克隆的基因的探針;(3)從微量mRNA中產生cDNA文庫;(4)產生大量用于序列分析的DNA;(5)分析 基因突變;(6)做染色體步移。
10.原位PCR技術:PCR雖然能擴增包括福爾馬林固定、石蠟包埋組織的各種標本的DNA,但擴增的DNA或RNA產物不能在組織細胞中定位,因而不能直接與特定的組織細胞特征相聯(lián)系,這是該技術一個局限性。原位雜交雖具有良好的定位能力,但由于其敏感性問題,尤其是在石蠟切片中,尚不能檢測出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR(In situ PCR,簡稱IS PCR),它可使擴增的特定DNA片段在分離細胞和組織切片中定位,從而彌補了PCR和原位雜交的不足,具有良好的應用前景。目前,已有多種設計的原位PCR擴增儀系統(tǒng)問世,使操作簡便,軟件靈活,已成為拉增固定細胞和石蠟包埋組織中特定DNA和RNA序列的有用工具。

IS PCR的技術特點

(1)既具有PCR的特異性與高靈敏性,又具有原位雜交的定位準確性;(2)測到低于2個拷貝量的細胞內特定DNA序列,甚至可檢測出單一細胞中的僅含一個拷貝的原病毒DNA;(3)有助于細胞內特定核酸序列定位與其形態(tài)學變化的結合分析;(4)可用于正;驉盒约毎,感染或非感染細胞的鑒定與區(qū)別。

IS PCR的基本方法

IS-PCR是PCR和原位雜交兩種技術的綾事,實質是一種將靶DNA或RNA在原位擴增后再進行原位雜交的技術,操作程序基本兼有兩種技術的所有過程,首先在適當處理的細胞和組織切片上滴加PCR反應液,然后把載玻片放入熱循環(huán)儀中進行擴增,最后通過標記的探針進行原位雜交檢測擴增產物。

初步應用

有關原位PCR技術應用成功的第一篇報道是對感染綿羊中樞神經系統(tǒng)visna病毒在綿羊脈絡從一細胞中檢查,通過PCR擴增,僅用150堿基對的短探針就可通過ISH檢查到了細胞內的visna病毒。從開始在試管內細胞行PCR擴增后再涂片做ISH(原位雜交)檢查,已發(fā)展到用福爾馬林固定、石蠟切片的常規(guī)病理組織方法做原位PCR檢查。有傳統(tǒng)的標記探針的原位PCR法(間接法),也有將標記物先標記PCR的引物,讓標記物擴增后再行ISH檢查的直接法。因此,目前就原位PCR方法而言,尚未能獲得統(tǒng)一,也即未能比較出哪一種方法最可靠簡便,各家報道的原位PCR技術中,在標本處理和種類上尚不同(細胞懸液、涂片、組織切片等),想檢測的靶核酸也不同(病毒或體細胞的DNA或mRNA),擴增的方法上有不同(單引物、多引物),最后顯示的方法也不同(直接法、間接法)。這些還都有待在今后的工作中積累經驗,以求一致。

原位PCR應用的課題,目前正片于開始階段,還很局限,對人體B細胞淋巴瘤中Ig單拷貝基因重組的檢查以及對人體外周血中單核細胞HLA-DQ不同亞型的測定,歸納起來,主要應用于兩方面;(1)檢測外源懷基因片段,集中在病毒感染的檢查上,如HIV、HPV、HBV、CMV等;(2)內源性基因片段,如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。

 
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