外顯子捕捉

外顯子捕捉(exon trapping) 是構(gòu)建一種載體，從其插入片段中識別和回收外顯子序列，從而克隆目的基因。捕捉外顯子的載體pETV—SD是一種反轉(zhuǎn)錄病毒穿梭載體(shuttle vector)，即可在不同種生物中如大腸桿菌和酵母，細菌和哺乳動物細胞等進行復制的載體(見圖5—14)。因為凡是有內(nèi)含子和外顯子的基因在轉(zhuǎn)錄后都要經(jīng)過RNA剪接，這就需要有剪接供體(splicing donor，SD)位點和剪接受體(splicing acceptor，SA)位點。因此，SA位點可作為基因的標志。pETV—咀載體的克隆位點上游有一個“外顯子捕捉序列”(exon trap cassette)，可用來識別載體的插入片段中有無SA位點。它含有β—珠蛋白(HBG)基因的第1個外顯子及其有功能的SD位點，該基因的間隔序列(IVS)和α，β—半乳糖苷酶(αβ—GAL)基因。操作步驟及其基本原理是：
(1)基因組DNA經(jīng)“霰彈法”切成小片段后，克隆在位于“外顯子捕捉序列”下游的克隆位點上。
(2)將這些重組載體匯總后感染反轉(zhuǎn)錄病毒的專宿包裝細胞系(ecotropicretroviral packaging cell line)——ψ2細胞系。ψ2細胞提供蛋白質(zhì)產(chǎn)物使載體(自身不能合成病毒蛋白質(zhì))成為反轉(zhuǎn)錄病毒在細胞里增殖。當反轉(zhuǎn)錄病毒在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄時，如果插入片段中包含有功能的SA位點，則有可能發(fā)生RNA剪接反應而將IVS切除。
(3)已剪接和未剪接的病毒RNA都包裝在病毒子(virion)中，從細胞培養(yǎng)液中收集后用來感染兼宿反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞系(amphotropic retroviral packagingcell line)PA-317。這使反轉(zhuǎn)錄病毒再進行一輪復制，并產(chǎn)生能感染猴腎細胞系COS細胞的高效價病毒原種。這樣做是由于上一輪克隆在病毒中的插入片段的剪接效率極低，而在第二輪復制時則大大提高了RNA剪接的機會。
(4)從第二個細胞系PA-317細胞中分離得到的病毒，用來感染組成型產(chǎn)生SV40T(腫瘤)抗原的COS細胞。病毒RNA基因組被反轉(zhuǎn)錄，并在載體上的SV40復制起點作用下，以環(huán)狀DNA附加體形式進行復制。
(5)從COS細胞中回收復制的附加體DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Dpn I 酶切后轉(zhuǎn)化細菌。在含卡那霉素(Kn)和5—氯—4—溴—3—吲哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)的培養(yǎng)基上挑選轉(zhuǎn)化子。盧—半乳糖苷酶可水解X—gal而生成藍色產(chǎn)物。因此，不產(chǎn)生β—半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)化子菌落則呈白色。
(6)只挑選出白色菌落作進一步研究的材料。白色菌落的生成可以有二種原因。一是由于基因發(fā)生突變，使夕—半乳糖苷酶失去活性；二是由于在反轉(zhuǎn)錄病毒生活周期的RNA時期中發(fā)生了剪接反應，從而丟失了α,β—半乳糖苷酶基因。
(7)如果是基因突變，則大多數(shù)將是缺失了載體中的“外顯子捕捉”部分，就可用人的口—珠蛋白基因片段為探針作菌落雜交，很快可得到驗證。
(8)如果是真正發(fā)生了RNA剪接事件，準確的剪接反應可切除作為標記的IVS，使人口—珠蛋白基因的第1外顯子與落入了捕捉陷阱的插入片段中的外顯子序列連接，這可直接測定其序列加以證明。
從捕捉到的外顯子出發(fā)，就可進一步用作探針去從基因組基因文庫或cDNA文庫中分離出基因。