反義核酸技術(shù)(antisense technology) 主要包括反義RNA ( antisense RNA) 和反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide) ,可以通過多種機(jī)制快速、可預(yù)測(cè)地調(diào)節(jié)培養(yǎng)組織或細(xì)胞的基因表達(dá),用來快速、有效地測(cè)定基因功能。
RNA 干擾技術(shù)
天然反義RNA 廣泛存在于原核和真核細(xì)胞內(nèi), 通過與靶基因形成RNA-RNA 或RNA-DNA 雙螺旋, 對(duì)基因功能起重要的調(diào)節(jié)作用。RNA 干擾技術(shù)(RNA interference ,RNAi) 正是利用了反義RNA 與正鏈RNA 形成雙鏈RNA ,特異性抑制靶基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)這一原理,成為研究轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的有效工具, 廣泛用于功能基因組學(xué)、基因治療和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究 。在這一技術(shù)中,早期使用雙鏈RNA (double-strand RNA , dsRNA) 作為干擾劑,核心技術(shù)是小分子干擾RNA( small interfering RNA , siRNA) 的設(shè)計(jì)與合成(哺乳動(dòng)物通常選擇21～23 bp dsRNA ,其他生物選擇更長(zhǎng)的片段) ,另外,還包括siRNA 的標(biāo)記、轉(zhuǎn)染和RNAi 的檢測(cè)。
然而,基因敲除實(shí)驗(yàn)顯示RNAi 存在一定程度的非特異性。分析認(rèn)為,RNAi 最初在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中所獲得的成功,部分是由于所使用的短鏈dsRNA 激活了胞內(nèi)dsRNA 依賴的蛋白激酶,引起細(xì)胞反應(yīng)并不斷累積。新近兩方面技術(shù)的發(fā)展使得RNAi 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中更加奏效: (1) 使用能使siRNA 穩(wěn)定表達(dá)的新的載體系統(tǒng)[21 ] ; (2) 利用人U6核內(nèi)小RNA ( snRNA) 啟動(dòng)子進(jìn)行單一RNA 轉(zhuǎn)錄單位的核內(nèi)表達(dá)[22 ] 。即通過轉(zhuǎn)染dsRNA 的胞內(nèi)表達(dá)并在胞內(nèi)降解成約20 bp 的dsRNA ,后者通過RNA依賴的RNA 合成酶復(fù)制,并結(jié)合到核酸酶復(fù)合物上,形成RNA 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex ,RISC) ,降解靶mRNA。
反義寡核苷酸
反義寡核苷酸主要通過RNase H介導(dǎo)的機(jī)制抑制基因表達(dá)。RNase H 是一種降解RNA2DNA 雜交鏈中RNA 的酶,產(chǎn)生5′-磷酸和3′-OH 端。RNase H酶切產(chǎn)物因缺少5′-cap 和3′-poly A 尾而被細(xì)胞中的5′和3′外切酶降解。這種高效的方法已被廣泛用于含有反義寡核苷酸序列樣的靶基因的下調(diào)( down regulation) 。實(shí)際上,這種技術(shù)對(duì)于鑒定mRNA 中的有效靶基因在某種程度上靠經(jīng)驗(yàn),因?yàn)樵S多靶基因不能顯示最佳活性�？梢酝ㄟ^增加反義寡核苷酸的種類克服這種局限,如在96 孔板上進(jìn)行PCR 后, 同時(shí)使用80 種以上的反義寡核苷酸進(jìn)行同一個(gè)mRNA表達(dá)的研究。整個(gè)過程僅用4～5 d。因此,這是一種高通量的基因功能檢定方法[16 ] �；瘜W(xué)修飾如2′-甲氧基乙基化〔2′- O-(2-methoxy) ethyl ,2′-MOE〕可降低細(xì)胞中核酸酶對(duì)寡核苷酸的降解作用,因而得到越來越多的研究應(yīng)用。反義寡核苷酸技術(shù)已被用于多種系統(tǒng)的基因功能研究,如蛋白磷酸化酶、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑p27/ kip (cyclin-dependent kinase inhibitor p27/ kip) 、凋亡蛋白抑制劑survivin 和抗凋亡蛋白BCL-XL 。反義技術(shù)廣泛用于體內(nèi)外模型中靶基因功能的驗(yàn)證,可部分替代基因敲除技術(shù)。
