鍵合相色譜法

鍵合相色譜法是由液－液色譜法即分配色譜發(fā)展起來的。鍵合相色譜法將固定相共價結合在載體顆粒上，克服了分配色譜中由于固定相在流動中有微量溶解，及流動相通過色譜柱時的機械沖擊，固定相不斷損失，色譜柱的性質逐漸改變等缺點。鍵合相色譜法可分為正常相色譜法和反相色譜法。
1.正常相色譜法
　　在正常相色譜法中共價結合到載體上的基團都是極性基團，如一級氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流動相溶劑是與吸附色譜中的流動相很相似的非極性溶劑，如庚烷、已烷及異辛烷等。由于固定相是極性，因此流動溶劑的極性越強，洗脫能力也越強，即極性大的溶劑是強溶劑。固定相與流動相的這種關系正好與液－固色譜法相同，稱這種色譜法為正常相色譜法。盡管如此，正常相色譜法的分離原理主要根據(jù)化合物在固定相及流動相中分配系數(shù)的不同進行分離，它不適于分離幾何異構體。
2.反相色譜法
　　在反相色譜法中共價結合到載體上的固定相是一些直鏈碳氫化合物，如正辛基等。流動相的極性比固定相的極性強。反相色譜法在高效液相色譜法中應用最廣泛。 在反相色譜法中，使溶質滯留的主要作用是疏水作用，在高效液相色譜中又被稱為疏溶劑作用。所謂疏水作用即當水中存在非極性溶質時，溶質分子之間的相互作用 、溶質分子與水分子之間的相互作用遠小于水分子之間的相互作用， 因此溶質分子從水中被“擠”了出去�？梢姺聪嗌�譜中疏水性越強的化合物越容易從流動相中擠出去，在色譜柱中滯留時間也長，所以反相色譜法中不同的化合物根據(jù)它們的疏水特性得到分離。反相色譜法適于分離帶有不同疏水基團的化合物，亦即非極性基團的化合物。此外，反相色譜法可用于分離帶有不同極性基團的化合物�？梢酝ㄟ^改變流動相的溶劑及其組成和pH，以影響溶質分子與流動相的相互作用，改變它們的滯留行為。另外，反相色譜中水的流動相中占的比例伸縮性很大，可以／從0-100％，從而使反相色譜可用于水溶性、脂溶性化合物的分離。反相色譜法中的固定相是被共價結合到硅膠載體上的直鏈飽和和烷烴，其鏈的長短不同，最長的是十八烷基，這也是使用得最多的固定相。直鏈飽和烷烴疏水特性隨著碳氫鏈的長度而增加，在反相色譜柱中溶質由于疏水作用而滯留的時間也將隨著碳氫鏈的長度而增加。在一般情況下這意味著用碳氫鏈長的反相色譜柱能得到較好的分辯率，在多數(shù)情況下是依靠反復來選擇色譜柱。由于反相色譜法的固定相是疏水的碳氫化合物，溶質與固定相之間的作用主要是非極性相互作用，或者說疏水相互作用，因此溶劑的強度隨著極性降低而增加。水是極性最強的溶劑，也是反相色譜中最弱的溶劑。在反相色譜中常常用和基礎溶劑，向其中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機溶劑，以得到不同強度的流動相，這些有機溶劑稱為修飾劑。反相色譜中最常用的有機溶劑有甲醇和乙腈，此外，乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。
在生化分析中，反相色譜的應用極廣�？捎糜冖侔被�酸和多肽的分析；②蛋白質的分離；③堿基，核酸和核酸酶的分析；④甾體化合物的分析；⑤以及其他如幾茶酚胺類，組胺，糖及維生素的分離。