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PCR丨RT-qPCR檢測(cè)的一步法與兩步法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2024-02-16
核心提示: RT-qPCR檢測(cè)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)是應(yīng)用于以RNA作為起始材料的PCR實(shí)驗(yàn)中的一
 RT-qPCR檢測(cè)

定量逆轉(zhuǎn)錄PCRquantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)是應(yīng)用于以RNA作為起始材料的PCR實(shí)驗(yàn)中的一種實(shí)驗(yàn)方法。在該方法中,總RNA或信使RNA(mRNA)首先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA(cDNA)。隨后,以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。RT-qPCR已被用于多種分子生物學(xué)的應(yīng)用中,其中包括基因表達(dá)分析、RNA干擾驗(yàn)證、微陣列驗(yàn)證、病原體檢測(cè)、基因測(cè)試和疾病研究。

 

RT-qPCR的一步法與兩步法

RT-qPCR可通過(guò)一步法或兩步法來(lái)完成。一步法RT-qPCR把逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增結(jié)合在一起,使逆轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶在同一管內(nèi)同樣緩沖液條件下完成反應(yīng)。一步法RT-qPCR只需要利用序列特異性引物。在兩步法RT-qPCR中,逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增過(guò)程是在兩個(gè)管中完成,使用不同的優(yōu)化的緩沖液、反應(yīng)條件、以及引物設(shè)計(jì)策略。

 

一步法

優(yōu)點(diǎn):

1. 由于兩步反應(yīng)都在一個(gè)管中完成,因此該方法具有更少的實(shí)驗(yàn)誤差;

2. 更少的移液步驟能夠減少污染的風(fēng)險(xiǎn);

3. 適用于高通量擴(kuò)增/篩選,快速且可重現(xiàn)性高。

缺點(diǎn):

1. 無(wú)法分別對(duì)兩步反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化;

2. 由于反應(yīng)條件是結(jié)合兩步反應(yīng)折中得到的,因此靈敏性不如兩步法;

3. 單一樣品檢測(cè)的靶點(diǎn)數(shù)較少。

 

兩步法

優(yōu)點(diǎn):

1.能夠建立可以長(zhǎng)期保存,并用于多次反應(yīng)的穩(wěn)定的cDNA庫(kù);

2. 靶基因和內(nèi)參基因能夠從同一個(gè)cDNA庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增,而不需要多重cDNA庫(kù);

3.能夠優(yōu)化單一反應(yīng)過(guò)程的反應(yīng)緩沖液和反應(yīng)條件;

4. 靈活的引發(fā)條件選擇。

缺點(diǎn):

1. 使用多個(gè)試管,以及更多的移液步驟會(huì)增加DNA污染的風(fēng)險(xiǎn),并且耗時(shí);
2. 相較于一步法,需要進(jìn)行更多的優(yōu)化。

 

 

編輯:songjiajie2010

 
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