一、簡介

本試劑盒是應用ELISA研發(fā)的新一代藥物殘留檢測產品，與儀器分析技術相比具有快速、簡便、準確和靈敏度高等特點,操作時間僅需55分鐘，能最大限度地減少操作誤差和工作強度。

二、試驗原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的卡那霉素將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗卡那霉素抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與殘留物卡那霉素的含量成負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中卡那霉素的含量。

三、適用范圍

可定性、定量檢測動物組織（肌肉、肝臟等）卡那霉素的殘留量。

四、交叉反應率

卡那霉素…………………………………………………100%

鏈霉素……………………………………………………〈1%

雙氫鏈霉素………………………………………………〈1%

新霉素……………………………………………………… 〈1%

五、使用單位需自備的設備及試劑

設備：

┅┅微孔板酶標儀450nm/630nm

┅┅均質器

┅┅電熱恒溫水浴鍋

┅┅振蕩器

┅┅渦旋儀

┅┅離心機

┅┅天平：感量0.01g

┅┅刻度移液管：10ml

┅┅洗耳球

┅┅容量瓶：500ml

┅┅聚苯乙烯離心管：2ml、50ml

┅┅微量移液器：單道 20ml～200ml、200ml～1000ml

多道 250ml

試劑

 

----十二水合磷酸氫二鈉(分析純)

----氯化鈉(分析純)

----氫氧化鈉(分析純)

----二水合磷酸二氫鉀(分析純)

----氯化鉀(分析純)

----去離子水

六、提供的材料與試劑

1、 96孔酶標板×1塊（包被有偶聯(lián)抗原）

2、標準液×6瓶：（1ml/瓶）

0ppb，0.5ppb，1.5ppb，4.5ppb，13.5ppb，40.5ppb

3、高濃度標準品：（1ml/瓶） 1ppm

4、酶標二抗       7ml ……………………………… 紅色帽

5、抗體工作液     10ml ………………………………綠色帽

6、底物液 A液   7ml ………………………………白色帽

7、底物液 B液    7ml ………………………………紅色帽

8、終止液         7ml ……………………………… 黃色帽

9、 20×濃縮洗滌液 40ml …………………………… 透明帽

10、2×濃縮復溶液   50ml ………………………………藍色帽

七、溶液的配制

配液1: 0.1M PBS溶液(PH=10-11)

            稱取13.4g十二水合磷酸氫二鈉.20g氯化鈉.0.32g氫氧化鈉.0.5g二水合磷酸二氫鉀.0.5g氯化鉀加去離子水溶解定溶至500ml。

配液2: 洗滌工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進行稀釋（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。

配液3: 復溶工作液

用去離子水將2×濃縮復溶液按1：1體積比進行稀釋（1份2×濃縮復溶液+1份去離子水），用于提取樣本的復溶，復溶工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。

八、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結果。

（c）未處理的樣本冷凍保存。

（d）處理好的樣本保存不可超過12h，應及時用于分析檢測。

雞肉＼豬肉、雞肝＼豬肝樣本前處理方法

----稱取2.0±0.05g去除脂肪的粉碎樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入6ml 0.1M PBS (PH=10~11)緩沖液（見配液1），混勻10min；

----放入60℃水浴環(huán)境中60min，取出水浴冷卻至室溫并搖勻；

----3000g以上，室溫離心10min；

----移取上清液，加入復溶工作液（見配液3），以1：4的體積比進行稀釋（100ml上清液+400 ml復溶工作液）；

----取50ml用于分析。

九、檢測步驟

測定前應須知：

1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。

2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

操作步驟：

1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

3、洗滌工作液在使用前也需回溫。

4、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5、加標準品/樣本：加入標準品/樣本20ml 到對應的微孔中，加入酶標二抗50ml/孔，再加入抗體工作液80ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應40min。

6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液（見配液2）250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。

7、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中避光反應15min（請參照注意事項8）。

8、測定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數(shù)據），測定每孔OD值。(若無酶標儀，則不加終止液用目測法可進行判定)。

十、結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含卡那霉素成負相關。

1、用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設樣本1的吸光度值為0.512，樣本2的吸光度值為0.899，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.950；0.5ppb為1.550；1.5ppb為1.200；4.5ppb為0.650；13.5ppb為0.301； 40.5ppb為0.110。則樣本1的濃度范圍是4.5ppb-13.5ppb再乘以其對應的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中卡那霉素殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是1.5ppb-4.5ppb再乘以其對應的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中卡那霉素殘留的濃度范圍。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以卡那霉素標準品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中卡那霉素實際殘留量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索�。�

樣本的稀釋倍數(shù)：

肌肉、肝臟樣品的稀釋倍數(shù)：20

十一、檢測方法靈敏度、準確度、精密度

試劑盒靈敏度：0.5ppb

樣本最低檢測限：

雞肉/肝,豬肉/肝…………………………………………… 10ppb

準確度：

雞肉/肝,豬肉/肝………………………………………… 90±15%

精密度：

試劑盒的變異系數(shù)均小于10%

十二、注意事項

1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、每加一種試劑前需要將其搖勻。

4、反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

6、儲存條件

保存試劑盒于2-8℃，不要冷凍，將不用的酶標板微孔板放進自封袋重新密封。標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、試劑變質的跡象

發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質，應當棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色時間為10-15min即可。若顏色較淺，可延長反應時間到20min（或更長），但不得超過30min。反之，則減短反應時間。

9、該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

十三、貯藏條件及保存期

     貯藏條件：保存試劑盒于2~8℃。

保存期：該產品有效期為12個月。