微生物的分離是指將目標(biāo)菌種從微生物群體(尤其是不同微生物群體)中分離出來(lái)的技術(shù),是微生物實(shí)驗(yàn)最基本的技術(shù)。微生物的分離培養(yǎng)方法主要有三種:劃線分離法,涂布平板法和傾注平板法。后兩種方法又可以同時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù),我們一起詳細(xì)學(xué)習(xí)一下微生物分離純化方法和技巧,微生物數(shù)量計(jì)數(shù)方法,一步步教你學(xué)習(xí)分離純化技術(shù),爭(zhēng)取從實(shí)驗(yàn)室小白進(jìn)軍分離培養(yǎng)大師。 一、劃線分離法 1.定義: 利用接種環(huán)將目標(biāo)菌種在固體培養(yǎng)基表面劃線,菌種逐步稀釋,培養(yǎng)后能夠長(zhǎng)出許多單一菌落,從而達(dá)到菌種分離純化的目的。 2.目的: 獲得純化的單菌落,越多越好。 3.操作步驟: (1)取菌種:取出目標(biāo)菌種,融化后,備用; (2)接種針滅菌:灼燒接種針進(jìn)行滅菌; (3)接種針冷卻:將接種針移至酒精燈旁邊冷卻; (4)蘸取菌種:甘油管用75%酒精消毒,待酒精揮發(fā)完全,在酒精燈火焰略微滅菌(防止烤糊),然后用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌種; (5)劃線:取已經(jīng)備好的固體平板,邊轉(zhuǎn)動(dòng)平板邊用酒精燈火焰滅菌,打開(kāi)平板(靠口朝酒精燈),用上述接種環(huán)在平板上劃線,先在一側(cè)連續(xù)劃線3-4次,邊轉(zhuǎn)動(dòng)平板邊用酒精燈灼燒接種環(huán),冷卻后,用接種環(huán)穿過(guò)第一次劃線部分繼續(xù)劃線3-4次,同樣方法進(jìn)行第三次劃線,或第四次劃線(根據(jù)菌液濃度和菌種類(lèi)型確定劃線次數(shù)),灼燒接種環(huán); (6)標(biāo)記:在平板底部邊緣處標(biāo)記菌種名稱,日期和其他信息; (7)培養(yǎng):放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng); (8)保存:待培養(yǎng)完成后保存于4℃冰箱,待用。 4.操作技巧: (1)甘油管菌種取出后,盡量不要放回去,或者標(biāo)記清楚,反復(fù)凍融菌種效果不好。 (2)灼燒接種針時(shí),一定要燒紅。 要燒紅!要燒紅!要燒紅!重要的事情說(shuō)三遍,不燒紅滅菌不徹底,容易污染,也可能出不來(lái)單菌落。
(3)燒紅的接種針一定要冷卻后再使用,如何確定接種針是否冷卻? 用接種針沿著固體培養(yǎng)基內(nèi)側(cè)邊緣或不可能用到的區(qū)域“輕點(diǎn)”,試一下固體培養(yǎng)基是否能夠融化,如果融化,說(shuō)明溫度過(guò)高,繼續(xù)冷卻;如果不融化,說(shuō)明接種針已經(jīng)冷卻,可以使用。 (4)甘油管菌種的濃度直接影響到劃線區(qū)域的分布,如何確定甘油管菌種濃度? 第一種方法,事先查閱試驗(yàn)記錄,確定甘油管菌種濃度。 第二種方法,借助顯微鏡觀察,粗略判斷甘油管菌種濃度。 第三種方法,測(cè)量吸光度,推測(cè)甘油管菌種濃度。
(5)劃線過(guò)程,要求掃尾,掃尾出單菌落效果良好。 但是,在實(shí)際操作中,很少人掃尾,因?yàn)橛袝r(shí)候看不清尾部在哪,直接在附近區(qū)域劃線,效果也不錯(cuò)。 (6)一定要標(biāo)記清楚菌種信息和劃線日期,一般情況在培養(yǎng)皿底部邊緣處標(biāo)記。 5.注意事項(xiàng):
(1)除樣品外,所有試驗(yàn)都必須在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行,在打掃衛(wèi)生、實(shí)驗(yàn)室消毒過(guò)程中,一定要做好個(gè)人防護(hù)。 (2)試驗(yàn)過(guò)程中,一定要正確使用酒精燈,避免著火。 (3)一定要在酒精燈旁邊操作。 (4)試驗(yàn)結(jié)束一定要將無(wú)關(guān)物品從超凈工作臺(tái)中取出,該滅菌的物品一定要滅菌后再處理,避免交叉污染。 (5)試驗(yàn)過(guò)程中,盡量減少人員流動(dòng)。 (6)試驗(yàn)過(guò)程中,避免手部接觸平板邊緣,以免造成污染。 (7)試驗(yàn)過(guò)程中,如果出現(xiàn)意外,比如說(shuō)著火,別著急,拿上濕抹布覆蓋即可。
1.定義: 待分離微生物樣品經(jīng)過(guò)一系列梯度(一般10倍遞增)稀釋后,使微生物菌體充分分散,成為單細(xì)胞,然后再取出一定量,涂布到固體培養(yǎng)基表面的方法,再經(jīng)過(guò)適宜的培養(yǎng)條件,形成單菌落的過(guò)程。 2.目的: (1)獲得純培養(yǎng)物-目標(biāo)菌。 (2)獲得純培養(yǎng)在微生物雜菌中的數(shù)量或比例—平板計(jì)數(shù)。
3.操作步驟: 梯度稀釋步驟:
(1)稱量:準(zhǔn)確稱取待測(cè)樣品1g或量取待測(cè)樣品1mL。 (2)稀釋:將上述樣品放入裝有99mL無(wú)菌生理鹽水(有小玻璃珠)的250mL三角瓶中,記錄。 (3)搖勻:將上述三角瓶放置于搖床上振蕩30min,使微生物細(xì)胞充分分散,靜置20-30s,即成10-2稀釋液。 (4)繼續(xù)稀釋:再用1mL無(wú)菌移液器,吸取上述稀釋液1mL,移入裝有9mL無(wú)菌水的試管中,吹吸3次,讓菌液和水混合均勻,即成10-3稀釋液。 (5)繼續(xù)稀釋:再換一支無(wú)菌移液器,吸取10-3稀釋液1mL,移入裝有9mL無(wú)菌水的試管中,吹吸3次,即成10-4稀釋液。 (6)繼續(xù)稀釋:以此類(lèi)推,連續(xù)梯度稀釋,制成10-7、10-8、10-9 等一系列稀釋菌液。 涂布平板步驟:
(1)標(biāo)記:將事先制備好的無(wú)菌平板上標(biāo)記10-7、10-8、10-9,每一個(gè)梯度稀釋設(shè)置三個(gè)重復(fù)。 (2)涂布:用無(wú)菌移液器分別吸取10-7稀釋液0.1mL放入編號(hào)10-7的3個(gè)平板中,然后用涂布棒或涂布器將菌液在平板上涂抹均勻,每個(gè)稀釋度用一個(gè)涂布器,用完涂布器酒精燈灼燒滅菌。 (3)繼續(xù)涂布:同樣涂布10-8稀釋液和10-9稀釋液,切記更換涂布棒。 (4)培養(yǎng):將涂布好的平板平放于超凈臺(tái)上靜置10min,使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi),然后將平板放置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。 (5)計(jì)數(shù):至長(zhǎng)出菌落后即可計(jì)數(shù)。 (6)保存:將單菌落平板儲(chǔ)存至4℃保存。
(1)計(jì)數(shù)原則,平板上菌落數(shù)30-300個(gè)為合格。 (2)如果只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù),則以該稀釋度平均菌落數(shù)除以涂布平板所用稀釋液體積(0.1mL),乘以稀釋倍數(shù)作為該樣品的細(xì)菌總數(shù)。 (3)如果有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合要求,則按照兩者菌落總數(shù)之比來(lái)決定,如果小于2,取兩者的平均值如果大于2,取較小的菌落總數(shù)。 4.操作技巧: (1)前幾個(gè)稀釋梯度,尤其是第一個(gè)梯度適當(dāng)放大稀釋倍數(shù)。 這樣不容易丟失目標(biāo)菌,也可以很好地對(duì)樣品進(jìn)行溶解。
(2)學(xué)會(huì)使用玻璃珠。 玻璃珠的作用是研磨,尤其是粉末或顆粒性樣品,可以將顆粒表面微生物與液體充分接觸。 (3)勤換槍頭或移液管。 這樣不容易造成不同稀釋度間混亂,防止不同梯度間取樣不準(zhǔn)。
(4)一定要搖勻。 平板涂布法的難點(diǎn)就在于稀釋,稀釋不準(zhǔn)確后面一切都化為零,一定要搖勻再取樣。
(5)利用顯微鏡粗略估測(cè)稀釋倍數(shù)。 并不是每一個(gè)樣品都需要稀釋到10-9,而是要根據(jù)樣品中微生物的數(shù)量進(jìn)行稀釋。 (6)涂布完成后,靜置10min再倒置培養(yǎng)。 靜置有利于微生物在培養(yǎng)基表面吸附,直接倒置培養(yǎng),可能倒置菌液向一側(cè)流動(dòng)。
(7)倒固體培養(yǎng)基的時(shí)候,可以適當(dāng)吹干或提前一到兩天倒平板。 平板表面沒(méi)有多余水分且比較濕潤(rùn),涂布時(shí)候既容易涂開(kāi)也不會(huì)造成出現(xiàn)菌苔。 5.注意事項(xiàng): (1)注意涂布力度,大小適宜,不應(yīng)劃破培養(yǎng)基的表面。 (2)如果發(fā)現(xiàn)平板上水太多,處理后再使用。 (3)切記寫(xiě)清楚標(biāo)記。 (4)試驗(yàn)完畢,注意灼燒涂布器,以免影響環(huán)境,造成交叉污染。
待分離微生物樣品經(jīng)過(guò)一系列梯度(一般10倍遞增)稀釋后,使微生物菌體充分分散,成為單細(xì)胞,然后再取出一定量稀釋液和固體培養(yǎng)基混勻,傾注到固體培養(yǎng)基的方法,再經(jīng)過(guò)適宜的培養(yǎng)條件,形成單菌落的過(guò)程。
獲得純培養(yǎng)在微生物雜菌中的數(shù)量或比例—平板計(jì)數(shù)。
梯度稀釋步驟:同平板涂布法。
(2)標(biāo)記:將事先制備好的無(wú)菌平板上標(biāo)記10-7、10-8、10-9,每一個(gè)梯度稀釋設(shè)置三個(gè)重復(fù)。
(3)傾注:將固體培養(yǎng)基冷卻至適合溫度后,用無(wú)菌移液器吸取10-7稀釋液0.1mL放入固體培養(yǎng)基中混勻,然后倒入編號(hào)10-7的3個(gè)培養(yǎng)皿中,或者用無(wú)菌移液器吸取10-7稀釋液0.1mL放入編號(hào)10-7的3個(gè)平板中,倒固體培養(yǎng)基,在培養(yǎng)皿中混勻。 (4)繼續(xù)傾注:同樣傾注10-8稀釋液和10-9稀釋液。 (5)培養(yǎng):將傾注好的平板平放于超凈臺(tái)上靜置,待凝固后,將平板放置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。
(2)培養(yǎng)基和稀釋液混勻過(guò)程中,沿壁搖勻,以免產(chǎn)生起泡,影響觀察和美觀。 沿壁搖勻,能夠保證培養(yǎng)基和稀釋液充分混合,也不會(huì)產(chǎn)生氣泡,切勿猛烈搖晃,氣泡太多,制成的平板無(wú)法計(jì)數(shù)。
(3)梯度稀釋過(guò)程,一般用試管,試管長(zhǎng)度要適宜,不宜過(guò)長(zhǎng),不方便操作,也不宜過(guò)短,無(wú)法搖勻或容易溢出。
(4)為了操作方便,可以采用離心管代替試管進(jìn)行梯度稀釋,上下顛倒,容易混勻。 (5)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用到的無(wú)菌水是無(wú)菌生理鹽水,保護(hù)細(xì)胞。
(1)整個(gè)過(guò)程,需要在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。 (2)固體培養(yǎng)基放置在水浴鍋中,也要經(jīng)常搖動(dòng),不能靜置。 (3)如果發(fā)現(xiàn)平板上水太多,處理后再使用。 (4)切記寫(xiě)清楚標(biāo)記。 (5)試驗(yàn)完畢,注意灼燒涂布器,以免影響環(huán)境,造成交叉污染。
平板涂布法是將不同梯度的稀釋液分別取少量,加入不同的固體培養(yǎng)基上,然后用涂布棒在平板表面涂布均勻。
二、涂布平板法
計(jì)數(shù)原則:
三、傾注平板法
1.定義:
2.目的:
3.操作步驟:
梯度稀釋步驟:同平板涂布法。
傾注平板步驟:
(1)制備培養(yǎng)基:準(zhǔn)備固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿,高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后固體培養(yǎng)基放置于水浴鍋中備用。
(6)計(jì)數(shù):待長(zhǎng)出單菌落后即可計(jì)數(shù)。
菌落計(jì)數(shù):同平板稀釋法。
4.操作技巧:
(1)固體培養(yǎng)基溫度不宜過(guò)高,過(guò)高會(huì)燙死微生物;溫度也不能太低,容易凝固結(jié)塊,無(wú)法和稀釋液混勻。如何確定合適的溫度?
用手心手背觸摸培養(yǎng)基,手心不燙手背燙的溫度,基本就是50℃左右(不同人溫度敏感性有一定差異)。
根據(jù)不同目標(biāo)菌種,確定合適的溫度,但一定要考慮固體培養(yǎng)基凝固的溫度,一般40℃左右凝固。
5.注意事項(xiàng):
四、平板涂布法和傾注平板法的區(qū)別和聯(lián)系
1.第一步都是先梯度稀釋樣品,稀釋好后,分離方式不同。
傾注平板法是將不同梯度的稀釋液分別取少量,和融化好的培養(yǎng)基混勻后倒入培養(yǎng)皿中。
2.固體培養(yǎng)基的處理方式不同
平板涂布法是將固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿滅菌后,培養(yǎng)基冷卻至合適溫度再倒平板,平板凝固后才可以使用,要么無(wú)法涂布。
傾注平板法是將固體培養(yǎng)基滅好后,放置在恒溫水浴鍋中,一直等到備好不同梯度稀釋液后,固體培養(yǎng)基冷卻至適合溫度跟不同梯度稀釋液混勻,然后倒入干凈的培養(yǎng)皿中。
傾注平板法為了涂布均勻平整,有時(shí)候需要事先倒一點(diǎn)固體培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿中,就是雙層平板。
3.平板涂布法優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)
(1)涂布技術(shù)不好,經(jīng)常涂布不勻,無(wú)法計(jì)數(shù)。
(2)不需要控制固體培養(yǎng)基溫度。
(3)可以將所有單菌落挑出來(lái),保存,用于后續(xù)試驗(yàn)。
4.傾注平板法優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)
(1)不需要涂布,省去了涂布不勻的麻煩。
(2)需要控制固體培養(yǎng)基溫度。
(3)無(wú)法將所有單菌落挑出來(lái)。