在實驗工作中,為使篩選達到事半功倍的效果,總的說來可從以下幾個途徑進行收集和篩選:

(1)向菌種保藏機構(gòu)索取有關(guān)的菌株,從中篩選所需菌株.

(2)由自然界采集樣品,如土壤、水、動植物體等,從中進行分離篩選.

(3)從一些發(fā)酵制品中分離目的菌株,如從醬油中分離蛋白酶產(chǎn)生菌,從酒醪中分離淀粉酶或糖化酶的產(chǎn)生菌等.該類發(fā)酵制品經(jīng)過長期的自然選擇,具有悠久的歷史,從這些傳統(tǒng)產(chǎn)品中容易篩選到理想的菌株.

    菌株的分離和篩選一般可分為采樣、富集、分離、產(chǎn)物鑒別幾個步驟.

    自然界含菌樣品極其豐富,土壤、水、空氣、枯枝爛葉、植物病株、爛水果等都含有眾多微生物,種類數(shù)量十分可觀.但總體來講土壤樣品的含菌量最多.

 

一、從土壤中采樣

    土壤由于具備了微生物所需的營養(yǎng)、空氣和水分,是微生物最集中的地方.從土壤中幾乎可以分離到任何所需的菌株,空氣、水中的微生物也都來源于土壤,所以土壤樣品往往是首選的采集目標.一般情況下,土壤中含細菌數(shù)量最多,且每克土壤的含菌量大體有如下的遞減規(guī)律:細菌(108)>放線菌(107)>霉菌(106)>酵母菌(105)>藻類(104)>原生動物(103),其中放線菌和霉菌指其孢子數(shù).但各種微生物由于生理特性不同,在土壤中的分布也隨著地理條件、養(yǎng)分、水分、土質(zhì)、季節(jié)而有很大的變化.因此,在分離菌株前要根據(jù)分離篩選的目的,到相應的環(huán)境和地區(qū)去采集樣品.

(一)根據(jù)土壤特點

1. 土壤有機質(zhì)含量和通氣狀況

    一般耕作土、菜園土和近郊土壤中有機質(zhì)含量豐富,營養(yǎng)充足,且土壤成團粒結(jié)構(gòu),通氣飽水性能好,因而,微生物生長旺盛,數(shù)量多,尤其適合于細菌、放線菌生長.山坡上的森林土,植被厚,枯枝落葉多,有機質(zhì)豐富,且陰暗潮濕,適合霉菌、酵母菌生長繁殖,微生物數(shù)量相應也比較少.

從土層的縱剖面看,1～5cm的表層土由于陽光照射,蒸發(fā)量大,水分少,且有紫外線的殺菌作用,因而微生物數(shù)量比5～25cm土層少;25cm以下土層則因土質(zhì)緊密,空氣量不足,養(yǎng)分與水分缺乏,含菌量也逐步減少.因此,采土樣最好的土層是5～25cm.一般每克土中含菌數(shù)約幾十萬到幾十億個,并且各種類型的細菌和放線菌幾乎都能分離到.如好氣芽孢桿菌、假單胞菌、短桿菌、大腸桿菌、某些嫌氣菌等.但總的說來酵母菌分布土層最淺,約5～10cm,霉菌和好氧芽孢桿菌也分布在淺土層.

2. 土壤酸堿度和植被狀況

    土壤酸堿度會影響微生物種類的分布.偏堿的土壤(pH7.0～7.5)環(huán)境,適合于細菌、放線菌生長.反之在偏酸的土壤(pH7.0以下)環(huán)境下,霉菌、酵母菌生長旺盛.由于植物根部的分泌物有所不同,因此,植被對微生物分布也有一定的影響.如番茄地或腐爛番茄堆積處有較多維生素C生產(chǎn)菌.葡萄或其他果樹在果實成熟時,其根部附近土壤中酵母菌數(shù)量增多.豆科植物的植被下,根瘤菌數(shù)量比其他植被下占優(yōu)勢.

3. 地理條件

    南方土壤比北方土壤中的微生物數(shù)量和種類都要多,特別是熱帶和亞熱帶地區(qū)的土壤.許多工業(yè)微生物菌種,如抗生素產(chǎn)生菌,尤其是霉菌、酵母菌,大多從南方土壤中篩選出來.原因是南方溫度高,溫暖季節(jié)長,雨水多,相對濕度高,植物種類多,植被覆蓋面大,土壤有機質(zhì)豐富,造成得天獨厚的微生物生長環(huán)境.

4. 季節(jié)條件

    不同季節(jié)微生物數(shù)量有明顯的變化,冬季溫度低,氣候干燥,微生物生長緩慢,數(shù)量最少.到了春天隨著氣溫的升高,微生物生長旺盛,數(shù)量逐漸增加.但就南方來說,春季往往雨水多,土壤含水量高,通氣不良,即使有微生物所需的溫度、濕度,也不利于其生長繁殖.隨后經(jīng)過夏季到秋季,約有7～10個月處在較高的溫度和豐富的植被下,土壤中微生物數(shù)量比任何時候都多,因此,秋季采土樣最為理想.

(二)采樣方法

    用取樣鏟,將表層5cm左右的浮土除去,取5～25處的土樣10～25,裝入事先準備好的塑料袋內(nèi)扎好.北方土壤干燥,可在10～30處取樣.給塑料袋編號并記錄地點、土壤質(zhì)地、植被名稱、時間及其他環(huán)境條件.一般樣品取回后應馬上分離,以免微生物死亡.但有時樣品較多,或到外地取樣,路途遙遠,難以做到及時分離,則可事先用選擇性培養(yǎng)基做好試管斜面,隨身帶走.到一處將取好的土樣混勻,取3～4撒到試管斜面上,這樣可避免菌株因不能及時分離而死亡. 

 

二、根據(jù)微生物生理特點采樣

1. 根據(jù)微生物營養(yǎng)類型

    每種微生物對碳氮源的需求不一樣,分布也有差異.研究表明,微生物的營養(yǎng)需求和代謝類型與其生長環(huán)境有著很大的相關(guān)性.如森林土有相當多枯枝落葉和腐爛的木頭等,富含纖維素,適合利用纖維素作碳源的纖維素酶產(chǎn)生菌生長;在肉類加工廠附近和飯店排水溝的污水、污泥中,由于有大量腐肉、豆類、脂肪類存在,因而,在此處采樣能分離到蛋白酶和脂肪酶的產(chǎn)生菌;在面粉加工廠、糕點廠、酒廠及淀粉加工廠等場所,容易分離到產(chǎn)生蛋白酶、糖化酶的菌株.若要篩選以糖質(zhì)為原料的酵母菌,通常到蜂蜜、蜜餞、甜果及含糖濃度高的植物汁液中采樣.在篩選果膠酶產(chǎn)生菌時,由于柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有較多的果膠,因此,從上述樣品的腐爛部分及果園土中采樣較好.若需要篩選代謝合成某種化合物的微生物,從大量使用、生產(chǎn)或處理這種化合物的工廠附近采集樣品,容易得到滿意的結(jié)果.在油田附近的土壤中就容易篩選到利用碳氫化合物為碳源的菌株.Hartman等人曾從乙烯氯化物的工廠附近分離到一株以乙烯氯化物為碳源和能源的分枝桿菌.含1%乙烯氯化物的空氣通過該菌培養(yǎng)可除去93%的毒性.也有人從含油污泥中篩選出能以20#機械潤滑油為惟一碳源的３株石油降解菌菌株,分別為動膠菌屬(Zoogloea sp.)、氮單胞菌屬(Azomonas sp.)和假單胞菌屬(Pseudomonas sp.).當然,也可將一種需要降解的物質(zhì)作為樣品中微生物的惟一碳源或氮源進行富集,然后分離篩選.

    此外,不少微生物對碳源的利用是不完全專一的,如以油脂為碳源的某些脂肪酶產(chǎn)生菌同樣也可以分解淀粉或其他糖類物質(zhì)獲得能源而生長.以石油等碳氫化合物為碳源的油田微生物,也可以利用一些糖類為碳源.具有以上特性的微生物在一般土壤、水、及其他樣品中也會存在.不過數(shù)量較少.

2. 根據(jù)微生物的生理特性

    在篩選一些具有特殊性質(zhì)的微生物時,需根據(jù)該微生物獨特的生理特性到相應的地點采樣.如篩選高溫酶產(chǎn)生菌時,通常到溫度較高的南方,或溫泉、火山爆發(fā)處及北方的堆肥中采集樣品;分離低溫酶產(chǎn)生菌時可到寒冷的地方,如南北極地區(qū)、冰窖、深海中采樣;分離耐壓菌則通常到海洋底部采樣.因為深海中生活的微生物能耐很高的靜水壓,如從海中篩到一株水活微球菌(Micrococcus aquivivus),它能在600個大氣壓下生長.分離耐高滲透壓酵母菌時,由于其偏愛糖分高、酸性的環(huán)境,一般在土壤中分布很少,因此,通常到甜果、蜜餞或甘蔗渣堆積處采樣.如有人曾在花蜜中分離到一株能耐30%高糖的耐高滲透壓的酵母菌.

三、特殊環(huán)境下采樣

1. 局部環(huán)境條件的影響

    值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和環(huán)境條件綜合因素的影響之外,還要受局部環(huán)境條件的影響.如北方氣候寒冷,年平均溫度低,高溫微生物相對較少.但在該地區(qū)的溫泉或堆肥中,卻會出現(xiàn)為數(shù)眾多的高溫微生物.氧氣充足的土層中按理只適合于好氧菌生長,實際上也有一些嫌氣菌生活,原因是好氣菌生長繁殖消耗了土層中大量氧氣,為嫌氣菌創(chuàng)造了局部生長的有利環(huán)境,故一般土壤中也能分離到嫌氣菌.

    海洋對于微生物來說是一個特殊的局部環(huán)境,盡管許多微生物也是經(jīng)河水、污水、雨水或塵埃等途徑而來,但由于海洋獨特的高鹽度、高壓力、低溫及光照條件,使海洋微生物具備特殊的生理活性,相應也產(chǎn)生了一些不同于陸地來源的特殊產(chǎn)物.前蘇聯(lián)學者發(fā)現(xiàn),20%～50%的海鞘、海參體內(nèi)的微生物可產(chǎn)生具有細菌毒性和殺菌活性的化合物.此外,美國馬里蘭大學也曾從海綿體內(nèi)的共生或共棲的細菌中分離到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物質(zhì).日本發(fā)現(xiàn)深海魚類腸道內(nèi)的嗜壓古細菌,80%以上的菌株可以生產(chǎn)EPA 和DHA,最高產(chǎn)量可達36%和24%.筆者從鱈魚腸道中分離到一株pj20細菌,產(chǎn)EPA14.78mg/L,在15℃培養(yǎng)時EPA占脂肪酸的 12.7%.日本也從海洋Thraustochvtrium aureum中篩選到一株產(chǎn)DNA達290mg/L的菌株.從海洋中采樣時,可參考其中不同種類微生物的分布規(guī)律:表層多為好氣異養(yǎng)菌,底層由于有機質(zhì)豐富,硫化氫含量高,厭氣性腐敗菌和硫酸鹽還原菌較多,兩層中則多為紫硫菌.

    具有特殊性質(zhì)的微生物通常分布在一些特殊的環(huán)境中.如得克薩斯州中南部的一個巖洞中存在著大量嗜堿性的,能進行氨氧化和產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物,其原因是這里生活這2000萬只蝙蝠,它們每晚吃釣5萬lb(磅)昆蟲,其排泄物造成了洞內(nèi)0m深的豐富營養(yǎng)層,這種特殊的環(huán)境對該種微生物起了選擇和富集的作用.還有人從侵蝕木船的一種蠕蟲腸道中分離到既能固氮又能降解纖維素的微生物.從考拉(Koala)熊腸中也曾分離到萜烯分解酶的產(chǎn)生菌,這可能因為考拉專吃含有高萜烯的桉樹類植物,給該種微生物創(chuàng)造了一個適宜的生長環(huán)境.美國從用硝酸處理過的花生殼中分離到一株節(jié)桿菌,該菌以木質(zhì)素為唯一碳源,它對處理過的花生殼的消化率可達到63%,再加入釀酒酵母使其蛋白質(zhì)含量達到13.6%,可作為牛、豬、雞飼料的添加劑.

2. 極端環(huán)境條件的影響

    微生物一般在中溫、中性pH條件下生長.但在絕大多數(shù)微生物所不能生長的高溫、低溫、高酸、高堿、高鹽或高輻射強度的環(huán)境下,也有少數(shù)微生物存在,這類微生物被稱為極端微生物.生活所處的特殊環(huán)境,導致它們具有不同與一般微生物的遺傳特性、特殊結(jié)構(gòu)和生理機能,因而在冶金、采礦及生產(chǎn)特殊酶制劑方面有著巨大的應用價值.

    嗜冷菌(thermophiles)的最適生長溫度為15℃,在0℃也可生長繁殖,最高溫度不超過20℃.主要分布于寒冷的環(huán)境中,如南北兩極地區(qū)、冰窟、高山、深海和土壤等低溫環(huán)境中.這類微生物在低溫發(fā)酵時可生產(chǎn)許多風味食品且可節(jié)約能源及減少中溫菌的污染.最適生長pH在8.0以上,通常在 pH9～10之間的微生物,稱之為嗜堿菌(alkaliphiles).大量不同類型的嗜堿菌已經(jīng)從土壤、堿湖、堿性泉甚至海洋中分離得到.由于大部分堿湖伴有高鹽,許多嗜堿菌同時也是嗜鹽菌.該類菌所產(chǎn)生的酶如耐堿蛋白酶和堿性纖維素酶可作為洗滌劑的舔加成分,也可將堿性淀粉酶用于紡織品工業(yè).嗜堿菌中的基因還可以用來調(diào)節(jié)其他細菌中基因產(chǎn)物的表達和分泌.嗜熱微生物是嗜熱菌最好的來源.有人從溫泉和海底火山口分離出了極端嗜熱菌.從意大利境內(nèi)的噴硫磺氣的火山口中分離到一種原始的微生物,在pH2和90℃時生長最好,其代謝類型極不尋常,既能作為耗氧型自養(yǎng)菌將硫氧化成硫酸,使自己增殖,又能作為厭氧菌用氫還原硫,生成H2S.