微絲的顯示方法步驟:
1. 用PBS液漂洗蓋片培養(yǎng)的原代細(xì)胞3次,每次30s;
2. 用2%的甲醛/PBS液固定原代細(xì)胞3min;
3. 用0.5%的三硝基甲苯/PBS處理3次,每次10min;
4. PBS漂洗3次;
5. 用羅丹明(rhodamine)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(phalloidin)(1:10)室溫中反應(yīng)15min;
6. PBS漂洗3次;
7. 60%甘油+熒光防淬劑封片;
8. 熒光顯微鏡觀察;
微管的顯示方法:
1. 用PBS液漂洗蓋玻片的原代細(xì)胞3次,每次30s;
2. 在室溫中用3%甲醛/PBS固定20min;
3. 用PBS液再漂洗3次,每次1min,最后用濾紙吸干多余的PBS液;
4. 投入冷丙酮中(-10—-20℃)7min;
5. 用PBS漂洗3次,每次1min,最后用濾紙吸干多余的PBS液;
6. 向直徑6cm的干凈碟皿中央滴一滴濃度為0.1—0.2mg/ml的一級抗微管蛋白抗體,令小蓋片細(xì)胞面向下扣在抗體液上,覆以皿蓋,于37℃溫箱中放置45min—1h;
7. 向碟皿內(nèi)勻速緩慢滴加PBS,令蓋片浮起在液面,用鑷子夾出,按步驟3處理;
8. 向干凈碟皿中央滴一滴濃度為0.1—0.2mg/ml的熒光標(biāo)記的二抗,其后操作按步驟6進(jìn)行;
9. 按步驟7和3操作;
10. 滴pH8.5的90%的甘油/PBS少許于載玻片上,把小蓋片的原代細(xì)胞面覆在大蓋片上;
11. 將蓋片置于熒光顯微鏡下觀察;