無菌驗(yàn)證分為設(shè)備檢查、煙霧測試和塵埃粒子測試、染色試驗(yàn)、輔助系統(tǒng)測試、正壓罩環(huán)境預(yù)測試、貼片實(shí)驗(yàn)、瓶內(nèi)、外挑戰(zhàn)測試、蓋內(nèi)、外挑戰(zhàn)測試、LG培養(yǎng)基預(yù)測試、產(chǎn)品測試及LG培養(yǎng)基測試十一步。本文會對瓶內(nèi)、外挑戰(zhàn)測試和蓋內(nèi)、外挑戰(zhàn)測試及LG培養(yǎng)基測試三大部分重點(diǎn)討論。

試驗(yàn)前準(zhǔn)備工作，需確保包裝物和產(chǎn)品初始菌含量滿足要求：

瓶子(新吹的)：<3CFU/瓶內(nèi)和瓶外；

瓶蓋：<20 CFU / 蓋；

產(chǎn)品：<100 CFU / ml營養(yǎng)菌；

            < 10 CFU / ml耐熱孢子；

工藝水：< 50 CFU / 250 ml。

包裝容器

空瓶：保證平均滅菌率為log6，是指在瓶子的內(nèi)部和瓶蓋消毒接種桿狀菌作為初始帶菌量。整個(gè)步驟如下：使用移液槍向130個(gè)瓶子接種枯草芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus ATCC 9372)孢子懸浮液(載量：每毫升0.1ml/10⁷CFU )并干燥(8到24小時(shí))。注意此處菌體和芽孢數(shù)量會隨時(shí)間和溫度損失。

120個(gè)瓶子由灌裝機(jī)灌注無菌水瓶并由旋蓋機(jī)封蓋(以下簡稱“測試樣”)，10個(gè)瓶子用于檢測初始帶菌量(以下簡稱“陽性對照樣”) (為了防止菌體數(shù)量過度損失，建議接種濃度要高1個(gè)log)。采用端點(diǎn)方法計(jì)算-過膜過濾方法確認(rèn)枯草芽孢桿菌孢子進(jìn)行評估。結(jié)果只受目標(biāo)菌影響。

瓶內(nèi)挑戰(zhàn)測試：

①選取260個(gè)以上完好空瓶；

②用枯草芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus ATCC 9372)孢子懸浮液接種空瓶：10⁵和10⁶各130瓶，接種位置依瓶型而定，但盡量選擇瓶內(nèi)凹陷不易殺菌的地方，并充分震蕩；

③空瓶正常風(fēng)干后準(zhǔn)備進(jìn)行測試，以最高生產(chǎn)速度，確保最短時(shí)間也能達(dá)到滅菌要求，先低濃度再高濃度，系統(tǒng)需預(yù)先調(diào)試好，無菌罐中準(zhǔn)備好無菌水；

④測試前隨機(jī)抽取10⁵的10個(gè)空瓶到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行陽性對照檢查，其方法為，到實(shí)驗(yàn)室將空瓶灌裝100ml無菌水（預(yù)先加入吐溫80輔助洗脫），蓋上無菌瓶蓋（預(yù)先去除防盜環(huán)并用鋁箔紙包好的經(jīng)121℃*15min濕熱滅菌后的瓶蓋），充分振蕩清洗，然后進(jìn)行梯度稀釋，至少稀釋5個(gè)梯度，取合適濃度的兩個(gè)梯度樣品，各取1ml進(jìn)行倒平板，每梯度樣品做2~3個(gè)平行，依GB 4789.2-2016菌落總數(shù)混釋法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)，得出空瓶的初始帶菌量；

⑤將120個(gè)10⁵空瓶手動放入輸送帶進(jìn)行殺菌、洗瓶、灌裝（灌裝100ml無菌水，根據(jù)瓶型，為維持設(shè)備運(yùn)轉(zhuǎn)穩(wěn)定性，可以適當(dāng)提高灌裝量）、封蓋，另120個(gè)10⁶空瓶重復(fù)以上操作；

⑥將灌裝好的產(chǎn)品在實(shí)驗(yàn)室充分振蕩后進(jìn)行膜過濾培養(yǎng)48小時(shí)后得出空瓶殺菌后殘留帶菌量，注意跟陽性對照實(shí)驗(yàn)室區(qū)分開；

瓶外挑戰(zhàn)測試：

①選取130個(gè)以上完好空瓶；

②用枯草芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus ATCC 9372)孢子懸浮液接種空瓶：10⁴和10⁵各65瓶，接種位置依瓶型而定，但盡量選擇瓶外凹陷不易殺菌的地方，接種后用記號筆在接種部位做好標(biāo)識；

③空瓶正常風(fēng)干后準(zhǔn)備進(jìn)行測試，手動掛到輸送帶進(jìn)行測試；

④測試前隨機(jī)抽取10⁴的5個(gè)空瓶到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行陽性對照檢查，其方法為：到實(shí)驗(yàn)室將空瓶接種位置剪開，放入已滅菌好的100ml無菌水的盒子中充分振蕩清洗，然后進(jìn)行梯度稀釋，至少稀釋4個(gè)梯度，得出空瓶外部初始帶菌量；

⑤將60個(gè)10⁴空瓶經(jīng)過正常的殺菌程序后，灌裝出口放置一次性無菌取樣袋。取出空瓶后，到實(shí)驗(yàn)室將接種標(biāo)識位置剪出，放入已滅菌的100ml無菌水的盒子中充分振蕩清洗后進(jìn)行膜過濾，或用已滅菌的棉簽來涂抹接種標(biāo)識位置，將棉簽放入已滅菌的100ml無菌水的盒子中充分振蕩清洗后進(jìn)行膜過濾，從而得出瓶外殺菌后殘留帶菌量。另60個(gè)10⁵空瓶重復(fù)以上操作；

驗(yàn)證判定：用陽性對照檢測的含菌量與殺菌后殘留的菌量進(jìn)行對照，從而判定殺菌力（衰減計(jì)數(shù)法），帶入以下公式：

Log(Rave ) =Log(∑Rc/Nsample)- Log(∑Sc/Ntest)

∑Rc：陽性對照樣帶菌總數(shù)；

Nsample：陽性對照樣數(shù)量；

∑Sc：測試樣殘留帶菌總數(shù)；

Ntest：測試樣數(shù)量；

Log(Rmin ) =Log(∑Rc/Nsample)- Log(Sc)

Sc：測試樣的殘留帶菌數(shù)最大樣品的菌落數(shù)；

Log(Rmin )：最低殺菌能力

瓶蓋：采用與瓶子相似的方法對瓶蓋(注意瓶蓋應(yīng)外觀良好，此處排除斷環(huán)等情況)接種。我們只對與產(chǎn)品接觸的瓶蓋部分進(jìn)行接種-螺紋線除外。接種60個(gè)瓶蓋作為取樣，10個(gè)瓶蓋用于檢測初始帶菌量。瓶蓋通過旋蓋機(jī)應(yīng)用到灌裝了無菌水的瓶子上。通過端點(diǎn)方法計(jì)算-過膜過濾方法確認(rèn)枯草芽孢桿菌孢子進(jìn)行評估。結(jié)果只受目標(biāo)菌影響。

蓋內(nèi)挑戰(zhàn)測試：

①選取130個(gè)以上完好瓶蓋；

②用枯草芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus ATCC 9372)孢子懸浮液接種瓶蓋：10⁵和10⁶各65個(gè)；

③瓶蓋正常風(fēng)干后準(zhǔn)備進(jìn)行測試，以最高生產(chǎn)速度，確保最短時(shí)間也能達(dá)到滅菌要求，先低濃度再高濃度，系統(tǒng)需預(yù)先調(diào)試好，無菌罐中準(zhǔn)備好無菌水；

④測試前隨機(jī)抽取10⁵的5個(gè)瓶蓋到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行陽性對照檢查，其方法為，到實(shí)驗(yàn)室將瓶蓋分別放入裝有100ml無菌水（預(yù)先加入吐溫80輔助洗脫）的盒子中，充分振蕩清洗，然后進(jìn)行梯度稀釋，至少稀釋5個(gè)梯度，取合適濃度的兩個(gè)梯度樣品，各取1ml進(jìn)行倒平板，每梯度樣品做2~3個(gè)平行，依GB 4789.2-2016菌落總數(shù)混釋法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)，得出蓋內(nèi)的初始帶菌量；

⑤將60個(gè)10⁵瓶蓋手動放入蓋整列機(jī)（接種蓋子和未接種蓋子用兩種顏色進(jìn)行區(qū)分），進(jìn)行殺菌、沖洗、吹干、封蓋，另60個(gè)10⁶瓶蓋重復(fù)以上操作；

⑥將封蓋后的產(chǎn)品（灌裝100ml無菌水，根據(jù)瓶型，為維持設(shè)備運(yùn)轉(zhuǎn)穩(wěn)定性，可以適當(dāng)提高灌裝量）在實(shí)驗(yàn)室充分振蕩后，進(jìn)行膜過濾，旋開的瓶蓋也放入濾杯中進(jìn)行沖洗過濾，依GB 4789.2-2016菌落總數(shù)混釋法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)，得出蓋內(nèi)的殺菌后殘留帶菌量；

蓋外挑戰(zhàn)測試：

①選取70個(gè)以上完好瓶蓋；

②用枯草芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus ATCC 9372)孢子懸浮液接種空瓶：10⁴和10⁵各35個(gè)，接種位置盡量選擇蓋外不易殺菌點(diǎn)，接種后用記號筆在接種部位做好標(biāo)識；

③瓶蓋正常風(fēng)干后準(zhǔn)備進(jìn)行測試，手動放入蓋整列機(jī)（接種蓋子和未接種蓋子用兩種顏色進(jìn)行區(qū)分），進(jìn)行殺菌、沖洗、吹干、封蓋，另35個(gè)10⁵瓶蓋重復(fù)以上操作；

④測試前隨機(jī)抽取10⁴的5個(gè)瓶蓋到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行陽性對照檢查，其方法為，到實(shí)驗(yàn)室將瓶蓋分別放入裝有100ml無菌水（預(yù)先加入吐溫80輔助洗脫）的盒子中，充分振蕩清洗，然后進(jìn)行梯度稀釋，至少稀釋4個(gè)梯度，取合適濃度的兩個(gè)梯度樣品，各取1ml進(jìn)行倒平板，每梯度樣品做2~3個(gè)平行，依GB 4789.2-2016菌落總數(shù)混釋法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)，得出蓋外的初始帶菌量；

⑤將30個(gè)10⁴瓶蓋手動放入蓋整列機(jī)（接種蓋子和未接種蓋子用兩種顏色進(jìn)行區(qū)分），進(jìn)行殺菌、沖洗、吹干、封蓋，灌裝出口處用一次性無菌取樣袋取樣。到實(shí)驗(yàn)室將瓶蓋旋開，放入已滅菌的100ml無菌水的盒子中充分振蕩清洗后進(jìn)行膜過濾，或用一次性無菌取樣袋直接在封蓋前的下蓋軌道處單個(gè)取樣，然后到實(shí)驗(yàn)室將蓋取出，直接放入已滅菌的100ml無菌水的盒子中充分振蕩清洗后進(jìn)行膜過濾，也可以將無菌水直接倒入無菌取樣袋中，清洗后進(jìn)行膜過濾，從而得出蓋外殺菌后殘留帶菌量。另30個(gè)10⁵瓶蓋重復(fù)以上操作；

蓋內(nèi)外的驗(yàn)證判定方法和瓶內(nèi)外的方法相同。

無菌環(huán)境和無菌介質(zhì)

無菌水：對無菌水制備裝置進(jìn)行微生物檢測，使用PCA和OSA對無菌水進(jìn)行關(guān)于飲料有害菌的微生物檢測，以驗(yàn)證其無菌性。無菌水用于：瓶蓋浸泡消毒、無菌沖瓶機(jī)、瓶口沖洗及外部SIP前后的沖水(噴沖消毒)。另外，熱水殺菌過程被檢測，包括設(shè)定的溫度，壓力和熱滯留時(shí)間。121℃作為SIP回管的溫度為前提條件。

無菌水無菌程度的檢驗(yàn)要在采用正確的殺菌后在無菌水供給的各個(gè)端口檢測：如瓶蓋消毒系統(tǒng)，沖瓶機(jī)機(jī)組，瓶蓋螺旋線的沖洗系統(tǒng)，設(shè)備外部自消毒所用的無菌水（在前面的外部自清洗后進(jìn)行）。

無菌空氣：在使用無菌空氣的機(jī)器上（灌裝機(jī)，沖瓶機(jī)，旋蓋的螺旋線消毒裝置，瞬時(shí)殺菌機(jī)的緩沖罐）必須對無菌空氣（通過取樣閥）的無菌性進(jìn)行檢測。

預(yù)測試：每次測試最小10,000瓶。灌裝量均為半灌裝。

為了給在瓶子中可能存在的細(xì)菌足夠的生長時(shí)間并避免取樣錯(cuò)誤，一定數(shù)量的經(jīng)過灌裝和封蓋的的樣品要在30℃的溫度下預(yù)保存3天。

無菌驗(yàn)證

無菌驗(yàn)證既低酸產(chǎn)品微生物確認(rèn)和驗(yàn)收測試，可以深入了解工藝流程和灌裝線的微生物狀況。

低酸飲料（PH＞4.5;奶、奶飲料和非碳酸天然礦泉水除外）商業(yè)殺菌率為：

1: 10,000 [pH > 4,5]

在10,000個(gè)灌裝的瓶子中，感染擴(kuò)增飲料有害菌的不多于1瓶。通常認(rèn)證采用linden grain來替代低酸產(chǎn)品。

在驗(yàn)收生產(chǎn)過程中經(jīng)過在30~35℃溫度下儲存14天后獲得上述殺菌率，即認(rèn)為被證實(shí)有效并完成。

產(chǎn)品測試：LG培養(yǎng)基須經(jīng)UHT138℃×32s滅菌或灌裝，驗(yàn)收生產(chǎn)運(yùn)行72小時(shí)，且在連續(xù)的3天中進(jìn)行。將從生產(chǎn)中逐步提取30,000個(gè)瓶子(開機(jī)5,000瓶，第24小時(shí)后提取5,000瓶，第48小時(shí)后提取8,000個(gè)，第72小時(shí)后提取10,000個(gè)，無菌率為每批：1:10,000 或總量：3:30,000)。其中，最后一步的取樣將按如下方式進(jìn)行：生產(chǎn)72小時(shí)后，依次打開隔離罩破壞無菌環(huán)境(3分鐘-3扇窗-每扇窗打開1分鐘, 選擇灌裝機(jī)和沖瓶機(jī)的窗子)。經(jīng)過SOP(時(shí)間≤15分鐘)后，開始生產(chǎn)，再取另外2,000瓶)。合計(jì)30,000瓶全部半瓶灌裝。待機(jī)時(shí)每間隔4小時(shí)進(jìn)行短時(shí)SOP。將這些瓶子至于30~35℃儲存3天之后，在光源下對儲存的瓶子作視覺檢驗(yàn)，以驗(yàn)證微生物影響(混濁、菌絲生長)。全檢后將這些瓶子倒置，7天后進(jìn)行再次全檢，如無異常，14天后再進(jìn)行全檢。