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通過驗證確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度的測定，方案適用于本公司各品種微生物限度檢驗方法的驗證。如下人員對方案負責(zé)：
方案具體內(nèi)容如下： 根據(jù)樣品特性制訂檢驗方法和檢驗條件，按制定的方法進行試驗，根據(jù)驗證結(jié)果判斷是否符合驗證標(biāo)準(zhǔn)。通過驗證以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定；確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的控制菌的檢查。若符合，按驗證的方法和條件進行藥品的微生物限度檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗方法和檢驗條件，再進行驗證，直至驗證結(jié)果符合設(shè)立的驗證標(biāo)準(zhǔn)。
一、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證 建立藥品的微生物限度檢查時，進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定。驗證試驗可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)同時進行。
1.1.驗證用菌株及菌種要求
上述菌株作為霉菌及酵母菌計數(shù)驗證用菌株。 驗證實驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代 （從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。
1.2.驗證菌菌液制備
1.3. 供試液的制備 無抑菌活性的供試品供試液的制備：
具有抑菌活性的供試品供試液的制備（當(dāng)供試品具有抑菌活性時，須先消除抑菌活性），其方法如下：
1.4. 菌液組 測定所加的試驗菌數(shù)。 采用平皿法，取試驗用的1mL菌液（約50～100CFU）分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。
1.5.試驗組
1.6. 供試品對照組 取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)（方法和試驗組相同）。 1.7.稀釋劑對照組 若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時，應(yīng)增加稀釋劑對照組，用稀釋劑代替供試品，加入試驗菌，使最終濃度為每1mL 供試液含50～100CFU，按試驗組的供試液制備方法和計數(shù)方法計數(shù)。 1.8.回收率計算 試驗組回收率計算：試驗組的菌回收率＝ 試驗組的菌回收率—供試品對照組平均菌落數(shù) ×100%菌液組的平均菌落數(shù) 稀釋劑對照組回收率計算：試驗組的菌回收率＝ 稀釋劑對照組平均菌落數(shù) ×100%菌液組的平均菌落數(shù) 計數(shù)方法驗證至少應(yīng)進行3次獨立平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。 結(jié)果判斷： 在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）≥70%。若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）≥70%。照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證，使試驗組菌回收率大于70%。
項目責(zé)任人：負責(zé)驗證方案的起草及具體實施。 驗證管理員：負責(zé)驗證工作的組織、協(xié)調(diào)及管理。 QA現(xiàn)場監(jiān)控員：負責(zé)驗證實施過程中的監(jiān)督檢查，取樣，確保結(jié)果的可靠性。 QC負責(zé)人：負責(zé)驗證方案中檢驗方法的審核及按照規(guī)定的取樣計劃對標(biāo)準(zhǔn)檢驗操作程序的準(zhǔn)確執(zhí)行，負責(zé)組織實施。 QC檢驗員：負責(zé)驗證方案的起草與參與實施，并對所測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性負責(zé)。 質(zhì)量部經(jīng)理：負責(zé)驗證方案及報告的審核和批準(zhǔn)。
大腸埃希菌【CMCC（B）44102】大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌， 金黃色葡萄球菌【CMCC（B）26003】金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌， 枯草芽孢桿菌【CMCC（B）63501】枯草芽孢桿菌為產(chǎn)芽孢桿菌， 上述菌株作為細菌計數(shù)驗證用菌株； 黑曲霉【CMCC（F）98003】黑曲霉為霉菌， 白色念珠菌【CMCC（F）98001】白色念珠菌為酵母菌，
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大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液制備：
接種大腸埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，35～37℃ 培養(yǎng)18～24小時。取此培養(yǎng)液1mL加0.9%無菌氯化鈉溶液9mL，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，制成每1mL含菌數(shù) 50～100CFU的菌懸液。
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白色念珠菌菌液制備：
接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10mL改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng) 24～48小時；取此培養(yǎng)液1mL加0.9%無菌氯化鈉溶液9mL，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，制成每1mL含菌數(shù) 50～100CFU的菌懸液。 接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5mL 0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，吸至無菌試管內(nèi)，取1mL加0.9%無菌氯化鈉溶液9mL，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4~10-6，制成每1mL含孢子數(shù)50～100CFU的孢子懸液。
稀釋劑： pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 液體供試品 ：供試品10mL置錐形瓶中，加入90mL稀釋劑，混勻，作為供試液（1：10）。 固體、半固體、粘稠性供試品供試品： 稱取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100mL，混勻后，作為供試液（1：10）。
培養(yǎng)基稀釋法 ：取供試液2mL，每0.2mL的供試液注一皿或每0.1mL的供試液注一皿；或取供試液1mL每0.5mL的供試液注一皿，傾注15mL的培養(yǎng)基，測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)，混勻，凝固，培養(yǎng)。每1mL供試液所注的平皿生長的菌數(shù)之和即為1mL的菌落數(shù)。計算每1mL供試液的平均菌落數(shù)， 按平皿法計數(shù)規(guī)則報告菌數(shù)；控制菌檢查時可加大增菌液的用量。 離心沉淀集菌法： 取一定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘（供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補至原量。 薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。 -
中和法： 選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當(dāng)?shù)膶Π被郊姿�，含重金屬的藥物在培養(yǎng)基內(nèi)加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸，洗必泰制劑加入聚山梨酸 80（3%）或卵磷脂（3%），鹵素中加入硫代硫酸鈉（0.1%）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性后測定。
平皿法：
取試驗可能用的最低稀釋級1mL供試液和50～100CFU試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。 培養(yǎng)基稀釋法（平皿法）： 取試驗可能用的最低稀釋級1mL供試液分別注入N個平皿中，每個平皿再注入50～100CFU試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。 薄膜過濾法： 取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100CFU試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。至少要一張膜。 -
離心沉淀集菌法 ：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1mL液體，并用稀釋劑洗滌管底，將洗滌液與1mL液體一起采用平皿法或薄膜過濾法計數(shù)。
