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本標準與 GB4789.35 2016相比 主要變化如下：
1、增加了實時熒光PCR方法為選做方法；
2、修改了乳酸菌的定義、樣品制備、培養(yǎng)時間;
3、修改了嗜熱鏈球菌和乳桿菌計數方法的描述;
4、修改了部分培養(yǎng)基成分、儲備液濃度和制備方法。
本標準規(guī)定了含乳酸菌食品中乳酸菌(lactic acid bacteria)的檢驗方法。
本標準適用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗。
2014年8月6日國家衛(wèi)生和計劃生育委員會公布的《可用于食品的菌種名單》中，還有乳球菌屬和片球菌屬�，F(xiàn)在不少乳品生產企業(yè)在發(fā)酵乳產品中添加了這些球菌。因此，進行發(fā)酵乳制品的乳酸菌檢驗時，無法避免這兩類球菌造成的干擾。
2.1 乳酸菌lactic acid bacteria
一類可發(fā)酵糖主要產生大量乳酸的細菌的通稱,不能液化明膠、不產生咧喋、革蘭氏陽性、無運動、無芽孢、觸酶陰性、硝酸還原酶陰性及細胞色素氧化酶陰性反應的細菌。本標準中乳酸菌主要為乳桿菌屬(Lactobacillus),雙歧桿菌屬(Bif idobacterium)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)。
修改了乳酸菌的定義，增加其生化現(xiàn)象的描述。
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外,其他設備和材料如下：
3.1 恒溫培養(yǎng)箱:36℃士1 ℃。
3.2 厭氧培養(yǎng)裝置:厭氧培養(yǎng)箱﹑厭氧罐、厭氧袋或能提供同等厭氧效果的裝置。
3.3 冰箱:2℃~8 ℃。（范圍擴大）
3.4 均質器及無菌均質袋,均質杯或滅菌乳缽。
3.5 渦旋混勻儀。
3.6 電子天平:感量0.001 g。（精度升高）
3.7 實時定量PCR儀。
3.8 恒溫水浴鍋或金屬浴。
3.9 離心機:離心力≥>10 000×g。
3.10 無菌試管:18 mm×180 mm,15 mm×100 mm。
3.11 無菌吸管: l mL(具 0.0l mL刻度)、10 mL(具 0.1 mI刻度)。
3.12 微量移液器和滅菌吸頭 :2 pL、10 u.L.100 pL200 p.L 1 000 uL。
3.13 無菌錐形瓶:500 mL,250 mL。
3.14 無菌平皿:直徑90 mm。
3.15 PCR管。
1.增加設備：厭氧裝置、渦旋混勻儀、實時定量PCR儀、恒溫水浴鍋或金屬浴、離心機、微量移液器和滅菌吸頭、無菌平皿、PCR管等；
2.電子天平精度由0.01g改為0.001g；主要是為了保證對于那些活菌菌種制品的稱量準確性；
3.冰箱溫度范圍由2℃~5 ℃改為2℃~8 ℃。
4.1 稀釋液:見附錄A中 A.1。（新增）
4.2 MRS(Man Rogosa Sharpe)瓊脂培養(yǎng)基:見附錄A中A.2。
4.3 莫匹羅星鋰鹽(Li Mupirocin)和半胱氨酸鹽酸鹽(Cysteine Hlydrochloride)改良MRS瓊脂培養(yǎng)基:見附錄A中A.3。
4.4 MC培養(yǎng)落( Modified Chalmers 培養(yǎng)基):見附錄A中A.4。
4.5 0.5%蔗糖發(fā)酵管:見附錄A中A.5。
4.6 0.5%纖維二糖發(fā)酵管:見附錄A中A.5。
4.7 0.5%麥芽糖發(fā)酵管:見附錄A中A.5。
4.8 0.5%甘露醇發(fā)酵管:見附錄A中A.5。
4.9 0.5%水楊苷發(fā)酵管:見附錄A中A.5。
4.10 0.5%山梨醇發(fā)酵管:見附錄A中A.5。
4.11 0.5%乳糖發(fā)酵管:見附錄A中A.5。
4.12 七葉苷發(fā)酵管:見附錄A中A.6。
4.13 革蘭氏染色液:見附錄A中A.7。
4.14 生理鹽水:見附錄A 中A.8。
4.15 DNA提取液:見附錄A中 A.9。（新增）
4.16 10xPCR緩沖液:見附錄A中 A.10。（新增）
4.17 莫匹羅星鋰鹽(C26HIx;O,- Li):化學純。
4.18 半胱氨酸鹽酸鹽(C: I1;ClNO,S):純度99 %。
4.19 dNTPs。（新增）
4.20 Taq DNA聚合酶:5 U/ pL。（新增）
4.21 七種乳酸菌引物探針。（新增）
4.22 滅菌去離子水。（新增）
增加培養(yǎng)基：稀釋液;
針對現(xiàn)有稀釋液對某些乳酸菌計數結果偏低等情況，修改了樣品前處理時所用稀釋液成分和溫度。經驗證，稀釋液“生理鹽水+1.5%胰蛋白胨（37 ℃預熱）”在乳酸菌檢驗中，計數結果優(yōu)于其它稀釋液；
增加實時熒光PCR檢測用試劑:DNA提取液、10xPCR緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、七種乳酸菌引物探針、滅菌去離子水等；
1.檢驗程序主要修改點為增加乳桿菌計數。
6.1 樣品制備
6.1.1 樣品的全部制備過程均應遵循無菌操作程序。
6.1.2 稀釋液在試驗前應在36℃士1 ℃條件下充分預熱15 min~30 min。
6.1.3 冷凍樣品可先使其在2℃~5℃條件下解凍，時間不超過18h,也可在溫度不超過45℃的條件解凍,時間不超過15min。
6.1.4 固體和半固體樣品:以無菌操作稱取25g樣品,置于裝有225 mL稀釋液的無菌均質杯內,于8 000×g ~10 000×g 均質l min~2 min,制成1∶10樣品勻液;或置于225 mL稀釋液的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打l min~-2 min制成l∶10 的樣品勻液。
6.1.5 液體樣品:液體樣品應先將其充分搖勻后以無菌吸管吸取樣品25 mL放入裝有225 mL稀釋液的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)或均質袋中,充分振搖或拍擊式均質器拍打l min~2 min,制成1 ∶10的樣品勻液。
6.1.6 經特殊技術(如包埋技術)處理的含乳酸菌食品樣品應在相應技術/工藝要求下進行有效前處理。
1.增加稀釋液預熱的操作；
2.增加特除技術處理的乳酸菌食品樣品的前處理要求；
3.液體樣品處理增加拍打均質器的操作。
6.2 稀釋及培養(yǎng)
6.2.1 用l mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液l mL,沿管壁緩慢注于裝有9 mL稀釋液的無菌試管巾(注意吸管或微量移液器吸頭尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻,制成1∶100 的樣品勻液。
6.2.2 另取l mL無菌吸管或微量移液器吸頭,按上述操作順序,做10倍遞增樣品勻液,每遞增稀釋一次,即換用1次l mL滅菌吸管或吸頭。
6.2.3 經特殊技術(如包埋技術)處理的含乳酸菌食品應按照相應技術/工藝要求進行稀釋。（新增）
6.3乳酸菌計數
6.3.1 乳酸菌總數
乳酸菌總數計數培養(yǎng)條件的選擇及結果說明見表1。
6.3.2 雙歧桿菌計數
根據對待檢樣品雙歧桿菌含量的估計,選擇2個~3個連續(xù)的適宜稀釋度,每個稀釋度吸取1mL樣品勻液于滅菌平皿內,每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后,將冷卻至48 ℃~50 ℃的莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿15 mL~20 mL,轉動平皿使混合均勻。培養(yǎng)基凝固后倒置于36 ℃士1℃厭氧培養(yǎng),根據雙歧桿菌生長特性，一般選擇培養(yǎng)48 h,若菌落無生長或生長較小可選擇培養(yǎng)至72 h,培養(yǎng)后計數平板上的所有菌落數。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內完成。
6.3.3嗜熱鏈球菌計數
根據待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數的估計,選擇2個~3個連續(xù)的適宜稀釋度,每個稀釋度吸取1mL樣品勻液于滅菌平皿內,每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后,將冷卻至48℃~50 ℃的MC瓊脂培養(yǎng)基及時傾注入平皿15 mL~20 mL,轉動平皿使混合均勻。培養(yǎng)基凝固后倒置于36 ℃土1℃有氧培養(yǎng),根據嗜熱鏈球菌生長特性,一般選擇培養(yǎng)48 h,若菌落無生長或生長較小可選擇培養(yǎng)至72 h。嗜熱鏈球菌在MC瓊脂培養(yǎng)基平板上的菌落特征為:菌落中等偏小,邊緣整齊光滑的紅色菌落，直徑2 mm士l mm,菌落背面為粉紅色。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內完成。
6.3.4 乳桿菌計數
根據待檢樣品活菌總數的估計,選擇2個~3個連續(xù)的適宜稀釋度,每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內,每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后,將冷卻至48 ℃~50 ℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿15 mL~20 mL,轉動平皿使混合均勻。培養(yǎng)基凝固后倒置于36℃士1℃厭氧培養(yǎng),根據乳桿菌生長特性，一般選擇培養(yǎng)48 h,若菌落無生長或生長較小可選擇培養(yǎng)至72 h。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內完成。
1.修改了文字描述；
2.培養(yǎng)基溫度和傾注的培養(yǎng)基的量均改為了一定的范圍；
3.培養(yǎng)時間根據培養(yǎng)生長特性可以培養(yǎng)48h至72 h。
6.4菌落計數
見GB 4789.2菌落計數部分。
6.5結果的表述
見GB 4789.2計算方法部分。
6.6菌落數的報告
見 GB 4789.2菌落總數的報告部分。
7.結果與報告
根據菌落計數結果出具報告,報告單位以CFU/g(mL)表示。
8. 乳酸菌的鑒定(可選做)
8.1 第一法 生化鑒定
8.1.純培養(yǎng)
挑取3個或以上單菌落,嗜熱鏈球菌接種于MC瓊脂平板,置36℃士1℃有氧培養(yǎng)48 h,乳桿菌屬接種于MRS瓊脂平板,置36℃士1℃厭氧培養(yǎng)48 h。
8.1.2 雙歧桿菌的鑒定
按GB 4789.34的規(guī)定操作。
8.1.3 涂片鏡檢:
嗜熱鏈球菌菌體鏡下呈球形或球桿狀,直徑為0.5 um~2.0 um,成對或成鏈排列,無芽孢,革蘭氏染色陽性。乳桿菌屬鏡下菌體形態(tài)多樣,呈長桿狀.彎曲桿狀或短桿狀,無芽孢,革蘭氏染色陽性。
1.修改了文字描述，強調形態(tài)是在鏡下的；
8.1.4 乳酸菌種主要生化反應
乳酸菌種主要生化反應見表2和表3。
8.2.1純培養(yǎng)
同8.1.1。
8.2.2DNA模板制備
使用接種環(huán)刮取 MC瓊脂平板或MRS瓊脂平板上的菌落2個~10個,懸浮于200uL滅菌生理鹽水中,充分混勻,10 000×g ~12 000×g 離心3 min,棄去上清。加入50uLDNA提取液渦旋混勻,置于100℃水浴或者金屬浴中10 min后迅速冷卻,10 000×g~12 000×g離心3 min。吸取上清液至新的PCR反應管內,作為DNA模板使用。提取后的DNA模板應置于4℃供當天使用,否則應于-20℃以下保存,并于1周內使用。
注:根據實驗室實際情況﹐也可用商品化試劑盒制備DNA模板。
8.2.3 PCR反應體系
總反應體系體積為25 uL:10× PCR緩沖液2.5 uL、上下游引物(10 umol/L)各l uL、探針(10 umol/L)0.5 pL,dNTPs(2.5 umol /L)3uL、Taq DNA聚合酶(5 U/uL)0.5uL,模板DNA 1uL、滅菌去離子水補足至25uL。每個反應均應設置至少2個平行。
注:反應體系中各試劑的量可根據具體情況或不同的反應總休積進行適當調整。亦可選用含有PCR級沖液、MgCl2 ,dNTP和Taq酶等成分基于Taqman探針的實時熒光PCR預混液。
8.2.4 PCR反應條件
50 ℃ 5 min,95℃預變性3 min,94 ℃變性5s,60 ℃退火延伸40 s(同時收集FAM熒光),進行40個循環(huán)。
注:PCR反應參數可根據基因擴增儀型號實時熒光PCR反應體系進行適當調整。
鑒定用引物和探針序列見表4。
8.2.5對照設置
檢測過程(包括DNA提取)中,每個反應均應設置陽性對照、陰性對照和空白對照。其中陽性對照模板為擴增片段的陽性克隆分子DNA或陽性菌株 DNA,陰性對照模板為非乳酸菌菌株 DNA,空白對照模板為無菌水。
8.2.6結果判讀
8.2.6.1對照的結果判讀
陽性對照出現(xiàn)典型擴增曲線,Ct≤30;陰性對照無典型擴增曲線或Ct≥40;空白對照無典型擴增曲線或Ct≥40。否則,結果視為無效。
8.2.6.2樣品的結果判讀
當樣品檢測Ct≥40時,判定樣品結果為某種乳酸菌陰性;當檢測Ct≤35,可判定該樣品結果為某種乳酸菌陽性;當檢測35<ct<40時,重復試驗,若重復試驗結果檢測ct≥40,則判定為某種乳酸菌陰性，否則,判定為某種乳酸菌陽性。< span=""></ct<40時,重復試驗,若重復試驗結果檢測ct≥40,則判定為某種乳酸菌陰性，否則,判定為某種乳酸菌陽性。
