食品伙伴網(wǎng)注：本方法源自奶牛乳房炎防治技術(shù)指南(試行)（農(nóng)醫(yī)發(fā)[20l0]29號(hào)）

　　1主要試劑和試驗(yàn)方法：

　　1.1革蘭氏染色：

　　1.1.1涂片、火焰固定。

　　1.1.2草酸銨結(jié)晶紫染1min。

　　草酸銨結(jié)晶紫染液的配制：

　　溶液A：結(jié)晶紫2g，95％酒精20mL，溶液B：草酸銨0.8g，蒸餾水80mL。將A、B溶液混合，用濾紙過(guò)濾后即可使用。

　　1.1.3自來(lái)水沖洗。

　　1.1.4加碘液覆蓋涂面染約1min。

　　1.1.5水洗，用吸水紙吸去水分。

　　1.1.6加95％酒精數(shù)滴，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色，20s后水洗，吸去水分。

　　1.1.7沙黃液（�。┤�2min后，自來(lái)水沖洗。干燥，鏡檢。

　　革蘭氏陽(yáng)性菌染色為藍(lán)色，革蘭氏陰性菌染色為紅色。

　　1.2觸酶試驗(yàn)：取槽置于潔凈的試管內(nèi)或玻片上，然后加3％過(guò)氧化氫數(shù)滴；或直接滴加3％過(guò)氧化氫于不含血液的細(xì)菌培養(yǎng)物中，立即觀察結(jié)果。有大量氣泡產(chǎn)生者為陽(yáng)性，無(wú)則為陰性。

　　1.3血漿凝固酶試驗(yàn)：吸取0.5mI。兔血漿與0.5mlj金黃色葡萄球菌浸液肉湯24h培養(yǎng)物充分混勻，置36±1℃培養(yǎng)，每隔半小時(shí)觀察一次，連續(xù)觀察6h，出現(xiàn)凝固，即將小試管傾斜或倒置時(shí)，內(nèi)容物不流動(dòng)，判為陽(yáng)性。同時(shí)做陰陽(yáng)性對(duì)照。

　　2乳樣的采集

　　選取出現(xiàn)臨床癥狀（或者懷疑為亞臨床型乳房炎）乳房炎奶牛，先用溫水，再用0.2％新潔爾滅擦洗乳房，最后用70％的酒精擦拭乳頭。采樣者同時(shí)進(jìn)行手指擦拭消毒。每個(gè)乳室先擠去頭2-3把奶，以排除污染的雜菌，每頭奶牛取乳樣5mI.于無(wú)菌乳樣杯中，待檢。

　　3病原菌的分離培養(yǎng)

　　初步診斷：將少量乳汁涂片、革蘭氏染色、鏡檢。如發(fā)現(xiàn)圓球形革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌可懷疑為葡萄球菌。

　　分離培養(yǎng)：將乳樣搖勻，分別取適量接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯（10％血清）、鮮血瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（平板）后，置于37℃溫箱培養(yǎng)24～48h。觀察每個(gè)平板中細(xì)菌生長(zhǎng)的情況，記錄菌落生長(zhǎng)表現(xiàn)。

　　普通瓊脂平板上，37℃，24～72h培養(yǎng)后，可見到濕潤(rùn)、光滑、隆起的圓形金黃色菌落。挑取典型菌落涂片、染色、鏡檢（鏡檢呈葡萄狀排列，無(wú)芽胞、莢膜，直徑0.5～lμm，革蘭氏染色陽(yáng)性），并挑取單個(gè)可疑菌落移植于肉湯和斜面培養(yǎng)基，經(jīng)37℃培養(yǎng)24～48h。24h后沒有長(zhǎng)菌的平板，再用相應(yīng)的增菌肉湯涂劃一次，繼續(xù)培養(yǎng)，24～48h后，再作檢查，以防漏檢。將剩余的乳樣存放于4℃冰箱內(nèi)備用。

　　營(yíng)養(yǎng)肉湯中呈渾濁生長(zhǎng)，管底有少量灰白色沉淀；

　　血液瓊脂平板中菌落較大，呈金黃色、圓形，周圍出現(xiàn)明顯的β-溶血。

　　4生化鑒定

　　觸酶試驗(yàn)：觸酶陽(yáng)性

　　血漿凝固酶試驗(yàn)：凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性

　　糖發(fā)酵試驗(yàn)：能分解甘露醇、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖

　　色素產(chǎn)生情況：能產(chǎn)生金黃色色素

　　5毒力試驗(yàn)

　　將上述經(jīng)過(guò)生化試驗(yàn)鑒定的細(xì)菌懸液用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋，對(duì)隨機(jī)分組的小鼠進(jìn)行腹腔注射接種，接種量為0.5mL／只（家兔皮下接種1.0mL或者靜脈接種0.1～0.5mL），能夠致死動(dòng)物或者內(nèi)臟出現(xiàn)膿腫可以確定有毒力。

　　6病原菌的重分離試驗(yàn)

　　對(duì)接種后發(fā)病、死亡小鼠（家兔）的肝臟進(jìn)行病原菌重分離。進(jìn)行菌落涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查，觀察所分離菌株是否為原接種菌。如果是則進(jìn)一步確定病原菌為金黃色葡萄球菌。