一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

了解稀釋平板計(jì)數(shù)的原理，掌握涂抹平板培養(yǎng)法和混合平板培養(yǎng)法，認(rèn)識(shí)細(xì)菌、放線菌、霉菌的菌落特征。

二、實(shí)驗(yàn)原理

    稀釋平板計(jì)數(shù)是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的單個(gè)菌落，即是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成這一培養(yǎng)特征設(shè)計(jì)的計(jì)數(shù)方法，即一個(gè)菌落代表一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)，首先將待測(cè)樣品制成均勻的系列稀釋液，盡量使樣品中的微生物細(xì)胞分散開，使成單個(gè)細(xì)胞存在（否則一個(gè)菌落就不只是代表一個(gè)細(xì)胞），再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)。經(jīng)培養(yǎng)后，由單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖形成菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可計(jì)算出樣品中的含菌數(shù)。此法所計(jì)算的菌數(shù)是培養(yǎng)基上長(zhǎng)出來的菌落數(shù)，故又稱活菌計(jì)數(shù)。一般用于某些成品檢定（如殺蟲菌劑等）、生物制品檢驗(yàn)、土壤含菌量測(cè)定及食品、水源的污染程度的檢驗(yàn)。

三、實(shí)驗(yàn)器材   

    1．活材料：蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）菌劑。

2．培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（附錄三、1）

3．器材：90ml無菌水、9ml無菌水、無菌平皿、lml無菌吸管、天平、稱樣瓶、記號(hào)筆、玻璃刮鏟等。

四、實(shí)驗(yàn)方法

    1．樣品稀釋液的制備  準(zhǔn)確稱取待測(cè)樣品l0g，放入裝有90ml無菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置搖床上振蕩20 min，使微生物細(xì)胞分散，靜置20-30s，即成10^-1稀釋液；再用1ml無菌吸管，吸取10^-1稀釋液lml，移入裝有9ml無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10^-2稀釋液；再換一支無菌吸管吸取10^-2稀釋液1 ml，移入裝有9ml無菌水的試管中，也吹吸三次，即成l0^-3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9等一系列稀釋菌液（圖22-1）。

圖22-1  平板計(jì)數(shù)法中樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養(yǎng)

用稀釋平板計(jì)數(shù)時(shí)，待測(cè)菌稀釋度的選擇應(yīng)根據(jù)樣品確定。樣品中所含待測(cè)菌的數(shù)量多時(shí)，稀釋度應(yīng)高，反之則低。通常測(cè)定細(xì)菌菌劑含菌數(shù)時(shí)，采用10^-7、10^-8、10^-9稀釋度，測(cè)定土壤細(xì)菌數(shù)量時(shí)，采用10^-4、10^-5、10^-6稀釋度，測(cè)定放線菌數(shù)量時(shí)，采用l0^-3、10^-4、10^-5稀釋度，測(cè)定真菌數(shù)量時(shí)，采用10^-2、10^-3、10^-4稀釋度。

2．平板接種培養(yǎng)  平板接種培養(yǎng)有混合平板培養(yǎng)法和涂抹平板培養(yǎng)法兩種方法。

    （1）混合平板培養(yǎng)法  將無菌平板編上10^-7、10^-8、10^-9號(hào)碼，每一號(hào)碼設(shè)置三個(gè)重復(fù)，用無菌吸管按無菌操作要求吸取10^-9稀釋液各1ml放入編號(hào)10^-9的3個(gè)平板中，同法吸取10^-8稀釋液各lml放入編號(hào)10^-8的3個(gè)平板中，再吸取10^-7稀釋液各lml放入編號(hào)10^-7的3個(gè)平板中（由低濃度向高濃度時(shí)，吸管可不必更換）。然后在9個(gè)平板中分別倒入已融化并冷卻至45—50℃的細(xì)菌培養(yǎng)基(圖22-2)，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻，冷疑后倒置，適溫培養(yǎng)。至長(zhǎng)出菌落后即可計(jì)數(shù)。

（2）涂抹平板計(jì)數(shù)法  涂抹平板計(jì)數(shù)法與混合法基本相同，所不同的是先將培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無菌平板中，待凝固后編號(hào)，然后用無菌吸管吸取0.1ml菌液對(duì)號(hào)接種在不同稀釋度編號(hào)的瓊脂平板上（每個(gè)編號(hào)設(shè)三個(gè)重復(fù)）。再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻（圖22-3），每個(gè)稀釋度用一個(gè)滅菌刮鏟，更換稀釋度時(shí)需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時(shí)，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒轉(zhuǎn)，保溫培養(yǎng)，至長(zhǎng)出菌落后即可計(jì)數(shù)。

五、實(shí)驗(yàn)作業(yè)：

  將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表中

計(jì)算結(jié)果時(shí)，常按下列標(biāo)準(zhǔn)從接種后的3個(gè)稀釋度中選擇一個(gè)合適的稀釋度，求出每克菌劑中的含菌數(shù)。

    （1）同一稀釋度各個(gè)重復(fù)的菌數(shù)相差不太懸殊。

    （2）細(xì)菌、放線菌、酵母菌以每皿30—300個(gè)菌落為宜，霉菌以每皿10—100個(gè)菌落為宜。

選擇好計(jì)數(shù)的稀釋度后，即可統(tǒng)計(jì)在平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果按下式計(jì)算。

混合平板計(jì)數(shù)法：

每克樣品的菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)

涂抹平板計(jì)效法：

    每克樣品的菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×10×稀釋倍數(shù)