志賀氏菌是引起人類急性感染性痢疾最為常見的食源性病原菌,俗稱痢疾桿菌,為革蘭氏陰性無芽孢桿菌,無動力,無莢膜,無鞭毛、有菌毛,在營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長良好。根據(jù)其抗原構(gòu)造的不同,可分為A、B、C、D四個亞群,分別是痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌和宋氏志賀氏菌。
志賀氏菌具有高度傳染性,易引起的細(xì)菌性痢疾,主要通過消化道途徑傳播,這與衛(wèi)生條件差,食物和水污染以及擁擠的生活條件有關(guān)。據(jù)調(diào)查,全球每年約有1.6億人患病,大約有110萬人死亡,其中絕大多數(shù)是兒童。在中國最為常見的是由福氏和宋內(nèi)志賀菌引起的菌痢,在內(nèi)陸地區(qū)分布廣泛,是各地衛(wèi)生部門重點檢測的對象。
目前,針對志賀氏菌的特點和危害,國家衛(wèi)生部已將志賀氏菌列入了肉、蛋、水產(chǎn)、飲料、調(diào)味品、糖果及酒類等食品的檢驗標(biāo)準(zhǔn)中,并制定了與之相對應(yīng)的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)——《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗志賀氏菌檢驗》(GB4789.5-2012)。今天,我們就共同來了解下食品中志賀氏菌的檢驗標(biāo)準(zhǔn)吧。
適用于食品中志賀氏菌的檢驗。
主要儀器
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分液器
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拍擊式均質(zhì)器
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定量接種環(huán)
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厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)
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生化鑒定系統(tǒng)
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志賀氏菌增菌肉湯
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麥康凱(MAC)瓊脂
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木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽(XLD)瓊脂
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三糖鐵(TSI)瓊脂
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半固體瓊脂
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營養(yǎng)瓊脂
志賀氏菌檢驗流程
4.1 樣品制備、增菌
以無菌操作取檢樣 25 g(mL),加入裝有滅菌 225 mL 志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)杯,用旋轉(zhuǎn)刀片式均 質(zhì)器以 8 000 r/min~10 000 r/min 均質(zhì);或加入裝有 225 mL 志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì) 器連續(xù)均質(zhì) 1 min~2 min,液體樣品振蕩混勻即可。于 41.5 ℃±1℃,厭氧培養(yǎng) 16 h~20 h。
4.2 分離
取增菌后的志賀氏增菌液分別劃線接種于XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板 上,于 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 20 h~24 h,觀察各個平板上生長的菌落形態(tài)。宋內(nèi)氏志賀氏菌的單個菌落直徑大 于其他志賀氏菌。若出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察,則繼續(xù)培養(yǎng)至 48 h 再進(jìn)行觀察。志賀氏菌在 不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征見表 1。
注:若在指定培養(yǎng)時間內(nèi),出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察, 可繼續(xù)培養(yǎng)至48h再進(jìn)行觀察。
4.3 初步生化試驗
1)分別在MAC瓊脂平板和XLD瓊脂平板上選取2個以上典型或可疑菌落;2)先用接種環(huán)挑取同一菌落,分別接種到TSI瓊脂斜面、半固體瓊脂和營養(yǎng)瓊脂斜面,再用接種針在TSI瓊脂斜面和半固體瓊脂斜面上進(jìn)行穿刺;3)標(biāo)記清楚后置于36±1℃培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)20~24h,觀察結(jié)果。
觀察TSI瓊脂中斜面產(chǎn)堿、底層產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣、不產(chǎn)硫化氫,且半固體瓊脂中無動力的菌株,挑取對應(yīng)的營養(yǎng)瓊脂斜面上生長的菌苔,進(jìn)行生化試驗和血清學(xué)分型。
4.4 生化試驗
用營養(yǎng)瓊脂斜面上生長的菌苔,進(jìn)行生化試驗,包括β-半乳糖苷酶、尿素、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶以及水楊苷和七葉苷的分解試驗。由于福氏志賀氏菌6型的生化特性和痢疾志賀氏菌或鮑氏志賀氏菌相似,必要時還需加做靛基質(zhì)、甘露醇、棉子糖、甘油試驗,也可做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗,應(yīng)為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。生化特性見表2。
4.5 附加生化實驗
由于某些不活潑的大腸埃希氏菌(anaerogenic E.coli)、A-D(Alkalescens-D isparbiotypes 堿性-異型) 菌的部分生化特征與志賀氏菌相似,并能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集;因此前面生化實驗符合志賀 氏菌屬生化特性的培養(yǎng)物還需另加葡萄糖胺、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(36 ℃培養(yǎng) 24 h~48 h)。志 賀氏菌屬和不活潑大腸埃希氏菌、A-D 菌的生化特性區(qū)別見表 3。
由于傳統(tǒng)生化試驗過程需要使用大量試劑,且還需保證有足夠量的菌苔,因此有時可能需再次對可疑菌落進(jìn)行擴(kuò)繁。針對這些問題,目前常采用生化試劑盒或生化鑒定系統(tǒng)來完成這一步驟,以減少操作人員的工作量、降低工作難度,縮短檢測周期。
4.6 血清學(xué)鑒定(選做項目)
凡疑為志賀氏菌,可挑取營養(yǎng)瓊脂斜面上的培養(yǎng)物,做玻片凝集試驗。
1)抗原準(zhǔn)備:志賀氏菌屬抗原結(jié)構(gòu)由菌體抗原(O)及表面抗原(K)組成。一般采用1.2%~1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗用的抗原。
2)清凝集反:在玻片上選取2塊約1cmx2cm的區(qū)域,用接種環(huán)挑取一環(huán)待測菌分別放入選定區(qū)域內(nèi),往其中一塊下部加1滴抗血清,另一區(qū)域下部加1滴生理鹽水(對照),分別將菌落研成乳狀液,將玻片傾斜搖動,使菌與抗體/生理鹽水混合,1min后并對著黑色背景觀察結(jié)果。
抗血清中出現(xiàn)凝結(jié)成塊的顆粒,且生理鹽水中沒有發(fā)生自凝現(xiàn)象,那么凝集反應(yīng)為陽性。
綜合以上生化試驗和血清學(xué)鑒定的結(jié)果,報告25g(mL)樣品中檢出或未檢出志賀氏菌。