一、菌落總數(shù)的概念及衛(wèi)生意義
1、菌落總數(shù)
食品檢樣經(jīng)過(guò)處理,在一定條件下培養(yǎng)后(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等),所得1mL (或1g)檢樣中形成菌落的總數(shù)。
按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定,即在需氧情況下,37℃培養(yǎng)48h,能在 平板計(jì)數(shù) 瓊脂平板上生長(zhǎng)的細(xì)菌菌落總數(shù),所以厭氧或微需氧菌、有特殊營(yíng)養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細(xì)菌,由于現(xiàn)有條件不能滿(mǎn)足其生理需求,故難以繁殖生長(zhǎng)。因此菌落總數(shù)并不表示實(shí)際中的所有細(xì)菌總數(shù),菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類(lèi),所以有時(shí)被稱(chēng)為雜菌數(shù),需氧菌數(shù)等。
2、細(xì)菌總數(shù)
指一定數(shù)量或面積的食品樣品.經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚砗,在顯微鏡下對(duì)細(xì)菌進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。其中包括各種活菌數(shù)和尚未消失的死菌數(shù)。細(xì)菌總數(shù)也稱(chēng)細(xì)菌直接顯微鏡數(shù)。通常以1g或1mL或1cm2樣品中的細(xì)菌總數(shù)來(lái)表示。
3 菌落總數(shù)在食品衛(wèi)生質(zhì)量評(píng)價(jià)中的意義
1)食品中細(xì)菌數(shù)量可反映該食品被污染的程度
新鮮的食品內(nèi)部一般是沒(méi)有或很少有細(xì)菌的,但由于外界污染情況不同,食品被細(xì)菌污染的多少就有所不同。食品中細(xì)菌數(shù)量越多,說(shuō)明被污染的程度就越嚴(yán)重,越不新鮮,對(duì)人體健康威脅越大。相反,食品中菌數(shù)越少,說(shuō)明該食品被污染的程度越輕,食品衛(wèi)生質(zhì)量越好,對(duì)人體健康影響也越小。
2)食品中細(xì)菌數(shù)量可預(yù)測(cè)食品耐放程度和時(shí)間
一般講,細(xì)菌數(shù)越少,食品耐放時(shí)間越長(zhǎng);相反,食品耐放時(shí)間就越短,例如用O℃保存牛肉,菌落總數(shù)為103cfu/cm2時(shí),可保存18天,而當(dāng)菌落總數(shù)增至lO5cfu/cm2時(shí)則只能保存7天。另外,用0℃保存魚(yú)時(shí),菌落總數(shù)為105cfu/cm2時(shí)可保存6天.而菌落總數(shù)在103cfu/cm2時(shí)則可保存12天。
3)食品中細(xì)菌數(shù)量可估測(cè)出食品腐敗狀況
一般認(rèn)為日常食品的活菌數(shù)為104~107cfu/g。而當(dāng)活菌數(shù)達(dá)到108cfu/g則可認(rèn)為處于初期腐敗階段。例如,活的家禽,皮膚表面的細(xì)菌數(shù)可低到1.5×103cfu/cm2。而加工后馬上檢測(cè)可達(dá)3.5×104cfu/cm2。當(dāng)菌落數(shù)為107cfu/cm2時(shí)表示確已經(jīng)腐敗,雞肉的細(xì)菌數(shù)達(dá)108cfu/cm2時(shí)可有氣味并變粘。
一般講,食品中細(xì)菌數(shù)量越多,則會(huì)加速腐敗變質(zhì)過(guò)程的進(jìn)程,甚至可能引起食用者的不良反應(yīng)。
二、菌落總數(shù)的常規(guī)檢驗(yàn)方法菌落總數(shù)的常規(guī)檢驗(yàn)方法(GB4789.2-2008):
基本操作一般包括:樣品的稀釋——傾注平皿——培養(yǎng)48(24)小時(shí)——計(jì)數(shù)報(bào)告。
(一)樣品的處理和稀釋?zhuān)?/span>1.操作方法:
1)、以無(wú)菌操作取檢樣25g(或25ml),放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi),經(jīng)充分振要或研磨制成1:10的均勻稀釋液。
固體檢樣在加入稀釋液后,最好置滅菌均質(zhì)器中以8000~10000r/min的速度處理1min,制成1:10的均勻稀釋液。
2)、用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml,沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi),振搖試管混合均勻,制成1:100的稀釋液。
3)、另取1ml滅菌吸管,按上項(xiàng)操作順序,制10倍遞增稀釋液,如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。
2.無(wú)菌操作:
操作中必須有“無(wú)菌操作”的概念,所用玻璃器皿必須是完全滅菌的。所用剪刀、鑷子等器具也必須進(jìn)行消毒處理。樣品如果有包裝,應(yīng)用75%乙醇在包裝開(kāi)口處擦拭后取樣。
操作應(yīng)當(dāng)在超凈工作臺(tái)或經(jīng)過(guò)消毒處理的無(wú)菌室進(jìn)行。瓊脂平板在工作臺(tái)暴露15分鐘,每個(gè)平板不得超過(guò)15個(gè)菌落。3.采樣的代表性:如系固體樣品,取樣時(shí)不應(yīng)集中一點(diǎn),宜多采幾個(gè)部位。固體樣品必須經(jīng)過(guò)均質(zhì)或研磨,液體樣品須經(jīng)過(guò)振搖,以獲得均勻稀釋液。
4.稀釋液:樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水,有的采用磷酸鹽緩沖液(或0.1%蛋白胨水),后者對(duì)食品已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。如對(duì)含鹽量較高的食品(如醬油)進(jìn)行稀釋?zhuān)梢圆捎脺缇麴s水。
(二)傾注培養(yǎng)
1.操作方法:
1)、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計(jì),選擇2~3個(gè)適宜稀釋度,分別在制10倍遞增稀釋的同時(shí),以吸取該稀釋度的吸管移取1mL稀釋液于滅菌平皿中,每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。
2)將涼至46℃平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15mL,并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿,混合均勻。同時(shí)將平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1mL稀釋液(不含樣品)的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。
3)待瓊脂凝固后,翻轉(zhuǎn)平板,置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h,取出計(jì)算平板內(nèi)菌落數(shù)目,乘以稀釋倍數(shù),即得每克(每毫升)樣品所含菌落總數(shù)。
2.傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在46℃水浴內(nèi)保溫,溫度過(guò)高會(huì)影響細(xì)菌生長(zhǎng),過(guò)低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無(wú)水浴,應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜。
傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一,從12~20ml不等,一般以15ml較為適宜,平板過(guò)厚可影響觀察,太薄又易于干裂。傾注時(shí),培基底部如有沉淀物,應(yīng)將底部棄去,以免與菌落混淆而影響計(jì)數(shù)觀察。
3.為使菌落能在平板上均勻分布,檢液加入平皿后,應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻,可正反兩個(gè)方向旋轉(zhuǎn),檢樣從開(kāi)始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過(guò)20min,以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。
4.培養(yǎng)溫度一般為37℃(水產(chǎn)品的培養(yǎng)溫度,由于其生活環(huán)境水溫較低,故多采用30℃)。培養(yǎng)時(shí)間一般為48h,有些方法只要求24h的培養(yǎng)即可計(jì)數(shù)。培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度,瓊脂平板培養(yǎng)48h后,培養(yǎng)基失重不應(yīng)超過(guò)15%。
5.為了避免食品中的微小顆粒或培基中的雜質(zhì)與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆,不易分辨,可同時(shí)作一稀釋液與瓊脂培養(yǎng)基混合的平板,不經(jīng)培養(yǎng),而于4℃環(huán)境中放置,以便計(jì)數(shù)時(shí)作對(duì)照觀察。
在某些場(chǎng)合,為了防止食品顆粒與菌落混淆不清,可在營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑(TTC),培養(yǎng)后菌落呈紅色,易于分別。
(三)計(jì)數(shù)和報(bào)告
1.操作方法:培養(yǎng)到時(shí)間后,計(jì)數(shù)每個(gè)平板上的菌落數(shù)?捎萌庋塾^察,必要時(shí)用放大鏡檢查,以防遺漏。在記下各平板的菌落總數(shù)后,求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù),計(jì)算出原始樣品中每克(或每ml)中的菌落數(shù),進(jìn)行報(bào)告。
2.到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間,應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù),應(yīng)將平板放置于0-4℃,但不得超過(guò)24h。
3.稀釋度選擇及菌落數(shù)報(bào)告方式
1). 若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi),計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值,再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),作為每克(或毫升)中菌落總數(shù)結(jié)果。
2). 若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí),按式(l)計(jì)算:
N=∑C/(n1+0.1n2)d……………………(1)
式中:
N―樣品中菌落數(shù);
∑C―平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和;
n 1―第一個(gè)適宜稀釋度接種平板個(gè)數(shù)
n2―第二個(gè)適宜稀釋度接種平板個(gè)數(shù);
d―稀釋因子(第一稀釋度)。
3). 若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300,則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),其他平板可記錄為多不可計(jì),結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。
4). 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。
5). 若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無(wú)菌落生長(zhǎng),則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。
6). 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30~300之間,其中一部分小于30或大于300時(shí),則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。
菌落總數(shù)的報(bào)告
1). 菌落數(shù)在100以?xún)?nèi)時(shí),按“四舍五人”原則修約,采用兩位有效數(shù)字報(bào)告。
2). 大于或等于100時(shí),第三位數(shù)字采用“四舍五人”原則修約后,取前兩位數(shù)字,后面用0代替位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數(shù)字。
3). 若所有平板上為蔓延菌落而無(wú)法計(jì)數(shù),則報(bào)告菌落蔓延。
4). 若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng),則此次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。
5). 稱(chēng)重取樣以CFU/g為單位報(bào)告,體積取樣以CFU/mL 為單位報(bào)告。
(四)特別注意
1 不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比(同一稀釋度的二個(gè)平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近),即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少,稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象,則應(yīng)視為檢驗(yàn)中的差錯(cuò)(有的食品有時(shí)可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象,如酸性飲料等),不應(yīng)作為檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。
2.當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí),如呈鏈狀生長(zhǎng)的菌落之間無(wú)任何明顯界限,則應(yīng)作為一個(gè)菌落計(jì),如存在有幾條不同來(lái)源的鏈,則每條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算,不要把鏈上生長(zhǎng)的每一個(gè)菌落分開(kāi)計(jì)數(shù)。如有片狀菌落生長(zhǎng),該平板一般不宜采用,如片狀菌落不到平板一半,而另一半又分布均勻,則可以半個(gè)平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。
3.當(dāng)計(jì)數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過(guò)多(即所有稀釋度均大于300時(shí)),但分布很均勻,可取平板的一半或1/4計(jì)數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。