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出廠檢驗(yàn)常見微生物指標(biāo)檢驗(yàn)方法
在我國的32大類食品生產(chǎn)許可中大都有菌落總數(shù)和大腸菌群的出廠檢驗(yàn)的規(guī)定，菌落總數(shù)和大腸菌群作為食品中安全指標(biāo)，也是影響產(chǎn)品質(zhì)量問題的常見指標(biāo)，常常受到生產(chǎn)企業(yè)和消費(fèi)者的高度關(guān)注。
今天，小編就帶大家一起來詳細(xì)的了解下食品中菌落總數(shù)和大腸菌群檢測方法。
菌落總數(shù)
食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等）培養(yǎng)后，所得每g（ml）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。
菌落總數(shù)的測定
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檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):
GB 4789.2-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定
菌落總數(shù):
食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下(如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等)培養(yǎng)后，所得每g檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。
制備1:10樣品勻液
稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)8000 rimin- 10000r/min均質(zhì)1 min-2 min.或放入盛有225 mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中。用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2 min。制成1:10的樣品勻液。
制備1:100樣品勻液
用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL沿管壁慢慢注入盛有9mL稀釋液的無菌試管中(注意吸管或吸頭不要觸及稀釋液面) ，振搖試管或換用支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻。制成1:100的樣品勻液。
制備10倍品勻液
按上一步操作程序。制務(wù)10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。
取樣并制備平板
選擇2個一3個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液) ，在進(jìn)行10倍遞增稀釋時，吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個釋釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內(nèi)空白對照。
及時將15mL-20mL冷卻至46℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(可放置于46℃士1℃恒溫水浴鍋中保溫)傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。
2.1 待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃士1℃培養(yǎng)48 h+2h。
2.2 如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋薄層瓊脂培養(yǎng)基(約4mL)，凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按2.1條件進(jìn)行培養(yǎng)。
3.1 應(yīng)對平皿上所有肉眼可見的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)
3.2 平板上菌落計(jì)數(shù)可使用自動化菌落計(jì)數(shù)儀,也可用肉眼觀察(必要時可用放大鏡觀察)記錄培養(yǎng)基上菌落數(shù)量和相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
3.3 選取菌落數(shù)在30-300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。
3.4 如果在一個稀釋度的兩個平板中,一個平板的菌落數(shù)在30-300之間,另一個大于300或小于30時,則以30-30之間平板菌落數(shù)作為本稀釋度結(jié)果記錄。
3.5 如所有平板的菌落數(shù)均在30CFU以下,則記錄平板中具體的菌落數(shù);如果沒有菌落生長,則記錄為小于1CFU。
3.6 如平板上菌落數(shù)大于300CFU,則記錄為多不可計(jì);但如果所有稀釋度的平板上落數(shù)均大于300CFU,則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)、其他稀釋度平板記錄為多不可計(jì)。
3.7 同一稀釋度的兩個平行平板中,一個平板有較大片狀落生長時、應(yīng)不進(jìn)行計(jì)數(shù)，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)。
3.8 如果同一稀釋度的兩個平行平板均有片狀菌落生長,選取片狀菌落不到平板一半，而剩余一半落分布均勻的平板,計(jì)數(shù)一半平板落數(shù)并乘以2代表全皿菌落數(shù)。
3.9 當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落同無明顯界線的狀生長時,則將每條單鏈作為一個菌落計(jì)數(shù)。
4.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在30-300CFU之間,計(jì)算兩個平板菌落數(shù)的平均值,再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),作為每g(mL)樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。
4.2 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。
4.3 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均大于300CFU,則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。
4.4 若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。
4.5 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30-30CFU之間,其中一部分小于30CFU或大于300CFU時,則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。
4.6 若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時,除30-300FU范圍之外的平板,按如下公式計(jì)算:
5.1 菌落計(jì)數(shù)以落形成單位(colony-forming units，CFU)表示,稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告,體積取樣以 CFU/ml為單位報(bào)告,表面取樣以 CFU/cm2為單位報(bào)告。
5.2 菌落數(shù)小于100CFU時，按”四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。
5.3 菌落數(shù)大于或等于100CFU時,將第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數(shù)字,后面用0代替位數(shù),也可用10的指數(shù)形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數(shù)字。
5.4 若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù),則報(bào)告菌落延。
5.5 若空白對照上有菌落生長,則此次檢測結(jié)果無效。
注：菌落總數(shù)結(jié)果計(jì)算與報(bào)告方式實(shí)例見表2.1
大腸菌群
主要來源于人畜糞便，是以糞便污染指標(biāo)來評價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。
01
大腸菌群分布較廣，在溫血動物糞便和自然界廣泛存在。
調(diào)查研究表明，大腸菌群細(xì)菌多存在于溫血動物糞便、人類經(jīng)�；顒拥膱鏊约坝屑S便污染的地方，人、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環(huán)境中則以大腸菌群其他型別較多。
02
大腸菌群的測定
GB 4789.3-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù) MPN法
固體和半固體樣品:
·稱取25g樣品,放入盛有225mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯 內(nèi) ,8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無 菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min,制成1∶10的樣品勻液。
液體樣品:
·以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶 (瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中充分振搖或置于機(jī)械振蕩器中振搖,充分混勻,制成1∶10的樣品勻液。
·用1mL 無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖 液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打,使其混合均勻,制成1∶100的樣品勻液。
·根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì),按上述操作,依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋 1次,換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過程不得超過15min。
每個樣品,選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種3管 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯,每管接種1mL(如接種量超過1mL,則用雙料 LST肉湯),36 ℃± 1 ℃ 培養(yǎng)24h±2h,觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生,24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(證實(shí)試驗(yàn)),如未 產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h,產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。
用接種環(huán)從產(chǎn)氣的 LST 肉湯管中分別取培養(yǎng)物1 環(huán),移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)管中, 36 ℃±1 ℃培養(yǎng)48h±2h,觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者,計(jì)為大腸菌群陽性管。
按3確證的大腸菌群 BGLB陽性管數(shù),檢索 MPN 表(見附錄 B),報(bào)告每g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值。
GB/T 4789.3-2003 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群測定
·制備1:10樣品勻液
以無菌操作將檢樣25g(mL)放于含有225mI.滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi),經(jīng)充分振搖或研磨做成1 : 10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器,以8 000 r/min~10 000 r/min的速度處理1 min,做成1 : 10的均勻稀釋液。
·制備1:100樣品勻液
用1mL無菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL,注入盛有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管中，振搖試管混合均勻，制成1:100的樣品勻液。
·制備10倍品勻液
領(lǐng)取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。
·移取樣品
根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)悠肺廴厩闆r的估計(jì),選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三。
將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，lmL及以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種三管，置36 ℃± 1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。
將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36 ℃± 1 ℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18h~ 24h,然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。
伊紅美藍(lán)瓊脂:伊紅Y和美藍(lán)抑制絕大部分革蘭氏陽性菌的生長.伊紅Y為酸性染料，美藍(lán)為堿性染料，瓊脂是凝固劑。大腸菌群發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸時，細(xì)菌帶正電荷，所以染上伊紅(紅色)，再與美藍(lán)結(jié)合形成紫黑色菌落，大部分有金屬光澤。
在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1- 2個進(jìn)行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36 ℃± 1 ℃培養(yǎng)24 h±2h,觀察產(chǎn)氣情況，凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。
根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL (g)大腸菌群的MPN值。
