純種分離
從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱(chēng)為微生物分離與純化。在分子生物學(xué)的研究及應(yīng)用中,不僅需要通過(guò)分離純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物,而且還必須隨時(shí)注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔”,防止其他微生物的混入。
純種分離的目的是將目的菌從混雜的微生物中分離出來(lái),獲得純培養(yǎng)。
如果樣品沒(méi)有經(jīng)增殖培養(yǎng)而直接進(jìn)行分離,那么要得到具有某一特性的純種,就更該細(xì)致、謹(jǐn)慎的操作。
純種分離的常用方法有4種:
傾注平板分離法、涂布平板分離法、平板劃線分離法和組織分離法。
1、傾注平板分離法:培養(yǎng)后,在培養(yǎng)基內(nèi)部及表面形成單菌落。
傾注平板法:將無(wú)自生理鹽水稀釋后的樣品加入無(wú)茵培養(yǎng)基混合均勻。待凝固后倒置培養(yǎng),內(nèi)部及表面形成單自落。
2、涂布平板分離法:培養(yǎng)后,在培養(yǎng)基表面形成單菌落。
因?yàn)閷⑽⑸飸乙合燃拥捷^燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡,且采用稀釋倒平板法也會(huì)使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長(zhǎng),因此在微生物學(xué)研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。
用途:一般多用于菌種的純化;
優(yōu)點(diǎn):可以觀察菌落特征,對(duì)混合菌進(jìn)行分離;
缺點(diǎn):不能計(jì)數(shù);
控制每個(gè)平板中微生物的菌落數(shù)在一定的范圍可獲得理想的分離效果,對(duì)于細(xì)菌和酵母,以每平板10~200菌落為佳,對(duì)于絲狀菌,則應(yīng)控制每平板菌落數(shù)30~50或更少。
如果分離菌絲呈蔓延性生長(zhǎng)的絲狀菌如根霉、毛霉等,則可以在培養(yǎng)基中添加0.1%左右的去氧膽酸鈉(去氧膽酸鈉在低PH下滅菌過(guò)程中易形成絮狀沉淀,可以通過(guò)分別滅菌、傾注平板前混合的方法避免)或山梨糖(在察氏培養(yǎng)基中加山梨糖0.1%,蔗糖0.01%),這樣可防止菌絲蔓延,便于挑取。
3、平板劃線分離法:能達(dá)到純種分離的目的。
經(jīng)培養(yǎng)后會(huì)得到呈分散狀態(tài)的單菌落純培養(yǎng)。
最簡(jiǎn)單的分離微生物的方法是平板劃線法,其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線”稀釋而達(dá)到分離目的的。劃線的方法很多,常見(jiàn)的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。
用途:一般多用于篩選菌株;用于平板培養(yǎng)基的回收率計(jì)數(shù)。
優(yōu)點(diǎn):可以計(jì)數(shù),可以觀察菌落特征。
缺點(diǎn):吸收量較少,較麻煩,平板不干燥效果不好,容易蔓延。如果菌液密度大的話,長(zhǎng)不出單菌落。
4、組織分離法:適用于從子實(shí)體或罹病的植株上分離高等真菌或植物致病菌。
分離時(shí),切取小塊受病組織,用10%漂白粉水或0.1%升汞液進(jìn)行表面消毒,并用無(wú)菌水洗滌數(shù)次后,移置于培養(yǎng)皿中的瓊脂培養(yǎng)基表面上,在適宜的溫度條件(25℃~26℃)培養(yǎng)。
受病組織內(nèi)潛伏的微生物開(kāi)始生長(zhǎng),經(jīng)3~5天后,就可以看到從受病組織周?chē)L(zhǎng)出菌絲,并向外擴(kuò)展。
經(jīng)菌落特征的觀察和鏡檢,確認(rèn)是所需分離的菌種時(shí),即用火焰滅菌的接種針從邊緣挑取少量菌體,移到斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
與增殖培養(yǎng)一樣,在純種分離時(shí)同樣也要根據(jù)實(shí)際情況對(duì)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂疲垣@得良好的分離效果。