PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間,一般為48h以內(nèi),有些最好于當日進行檢查,大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。
但有時仍會與到這樣那樣的問題,影響檢測結(jié)果的判斷,具體歸類為以下常見的4點,描述如下:
問題一:無擴增產(chǎn)物
現(xiàn)象:正對照有條帶,而樣品則無。
原因:
1、模板:含有抑制物,含量低。
2、Buffer對樣品不合適。
3、引物設(shè)計不當或者發(fā)生降解。
4、反應(yīng)條件:退火溫度太高,延伸時間太短。
對策:
1、純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量。
2、更換Buffer或調(diào)整濃度。
3、重新設(shè)計引物(避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu))或者換一管新引物。
4、降低退火溫度、延長延伸時間。
問題二:非特異性擴增
現(xiàn)象:條帶與預(yù)計的大小不一致或者非特異性擴增帶。
原因:
1、引物特異性差。
2、模板或引物濃度過高。
3、酶量過多。
4、Mg2+濃度偏高。
5、退火溫度偏低。
6、循環(huán)次數(shù)過多。
對策:
1、重新設(shè)計引物或者使用巢式PCR。
2、適當降低模板或引物濃度。
3、適當減少酶量。
4、降低鎂離子濃度。
5、適當提高退火溫度或使用二階段溫度法。
6、減少循環(huán)次數(shù)。
問題三:拖尾
現(xiàn)象:產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。
原因:
1、模板不純。
2、Buffer不合適。
3、退火溫度偏低。
4、酶量過多。
5、dNTP、Mg 2+濃度偏高。
6、循環(huán)次數(shù)過多。
對策:
1、純化模板。
2、更換Buffer。
3、適當提高退火溫度。
4、適量用酶。
5、適當降低dNTP和鎂離子的濃度。
6、減少循環(huán)次數(shù)。
問題四:假陽性
現(xiàn)象:空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物。
原因:
靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染。
對策:
1、操作時應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。
2、除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。
3、各種試劑最好先進行分裝,然后低溫貯存。
但有時仍會與到這樣那樣的問題,影響檢測結(jié)果的判斷,具體歸類為以下常見的4點,描述如下:
問題一:無擴增產(chǎn)物
現(xiàn)象:正對照有條帶,而樣品則無。
原因:
1、模板:含有抑制物,含量低。
2、Buffer對樣品不合適。
3、引物設(shè)計不當或者發(fā)生降解。
4、反應(yīng)條件:退火溫度太高,延伸時間太短。
對策:
1、純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量。
2、更換Buffer或調(diào)整濃度。
3、重新設(shè)計引物(避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu))或者換一管新引物。
4、降低退火溫度、延長延伸時間。
問題二:非特異性擴增
現(xiàn)象:條帶與預(yù)計的大小不一致或者非特異性擴增帶。
原因:
1、引物特異性差。
2、模板或引物濃度過高。
3、酶量過多。
4、Mg2+濃度偏高。
5、退火溫度偏低。
6、循環(huán)次數(shù)過多。
對策:
1、重新設(shè)計引物或者使用巢式PCR。
2、適當降低模板或引物濃度。
3、適當減少酶量。
4、降低鎂離子濃度。
5、適當提高退火溫度或使用二階段溫度法。
6、減少循環(huán)次數(shù)。
問題三:拖尾
現(xiàn)象:產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。
原因:
1、模板不純。
2、Buffer不合適。
3、退火溫度偏低。
4、酶量過多。
5、dNTP、Mg 2+濃度偏高。
6、循環(huán)次數(shù)過多。
對策:
1、純化模板。
2、更換Buffer。
3、適當提高退火溫度。
4、適量用酶。
5、適當降低dNTP和鎂離子的濃度。
6、減少循環(huán)次數(shù)。
問題四:假陽性
現(xiàn)象:空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物。
原因:
靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染。
對策:
1、操作時應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。
2、除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。
3、各種試劑最好先進行分裝,然后低溫貯存。