等位基因特異性PCR,設(shè)計(jì)引物時(shí)選擇在基因組的多態(tài)性區(qū)域,使等位基因的突變定位在(或接近)引物的3'端,在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆磻?yīng)條件下,存在錯(cuò)配堿基的引物不能起始復(fù)制,而只有完全匹配的引物才能起始復(fù)制,產(chǎn)生的產(chǎn)物因此顯示不同的基因型。
2、Assembly PCR(也稱作Polymerase Cycling Assembly或PCA):
組裝PCR通過使用多個(gè)具有短重疊區(qū)的長的寡核苷酸來合成長的DNA鏈的方法。通過寡核苷酸產(chǎn)生一條條正向或反向DNA鏈,而寡核苷酸的重疊區(qū)則確定鏈組裝的順序,因此可有選擇性的產(chǎn)生最終的長鏈DNA分子。
3、Asymmetric PCR:
不對稱PCR,可選擇性的擴(kuò)增出靶DNA的一條鏈,從而用于測序反應(yīng)或制備單鏈雜交探針。反應(yīng)中限制一個(gè)引物的加入量,隨著這一引物的用盡,后續(xù)的擴(kuò)增中另一引物延伸的產(chǎn)物量大大過量。這一技術(shù)的關(guān)鍵是使用的限制引物的量要合適,引物量過多,則產(chǎn)物主要是雙鏈DNA;引物量過少,在前幾輪循環(huán)就被耗盡,結(jié)果導(dǎo)致單鏈的產(chǎn)量減少。在不對稱PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展出Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR,線性指數(shù)PCR),使數(shù)量限制的引物比過量的引物的解鏈溫度更高,從而維持較高的反應(yīng)效率。
4、Hot start PCR:
熱啟動(dòng)PCR,是提高PCR特異性和可信度的最好的方法之一。通過阻止溫度升高到變性溫度前的PCR反應(yīng)的發(fā)生而阻止引物與基因組DNA上潛在的高同源性區(qū)域結(jié)合引起的錯(cuò)誤引發(fā)(mispriming)。同時(shí)熱啟動(dòng)還使引物通過互補(bǔ)區(qū)域堿基配對而擴(kuò)增產(chǎn)生的引物二聚體量大大降低。
熱啟動(dòng)PCR可通過三種方式實(shí)現(xiàn):
1)手動(dòng)熱啟動(dòng):配置反應(yīng)液時(shí)忽略一種關(guān)鍵成分(聚合酶、Mg離子或dNTP),當(dāng)反應(yīng)液升溫到80℃以上或變性溫度時(shí)再加入。手動(dòng)熱啟動(dòng)操作繁瑣,而且因?yàn)樵黾恿艘淮伍_蓋操作,增加了污染的機(jī)會(huì),同時(shí)由于管與管間的加樣誤差,可能使平行樣品間擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生差異;更簡單的手動(dòng)熱啟動(dòng)是在冰上配置反應(yīng)液,待熱蓋升溫到變性溫度,按下擴(kuò)增儀的暫停鍵,立即將反應(yīng)管放在儀器上開始反應(yīng),當(dāng)然這種方法的可信度也最低
2)將聚合酶用石蠟珠包裹(或在反應(yīng)液上部滴一滴融化的石蠟,待其凝固后,將聚合酶加到石蠟層的上部)使其與反應(yīng)液的其它成分分開,直到反應(yīng)液升溫融化石蠟后,酶才進(jìn)入反應(yīng)液中;3)使用熱啟動(dòng)DNA聚合酶,這種酶通過化學(xué)修飾或與抗體結(jié)合,常溫下沒有活性,而只有當(dāng)反應(yīng)液加熱到變性溫度一段時(shí)間后,酶的活性才被釋放。使用熱啟動(dòng)DNA聚合酶相比手動(dòng)熱啟動(dòng)操作簡便,缺點(diǎn)是用熱啟動(dòng)DNA聚合酶的價(jià)格較高。
5、InterSequence-Specific PCR(ISSR-PCR):
序列間特異性PCR:一種DNA指紋圖譜技術(shù),所選的引物定位在基因組的片段重復(fù)區(qū)(如Alu族),擴(kuò)增后產(chǎn)生基于不同產(chǎn)物長度的唯一的指紋圖譜。
6、Ligation-mediated PCR:
連接介導(dǎo)PCR,首先使用小的寡核苷酸接頭連接靶DNA片段,然后選擇與接頭結(jié)合的PCR引物來擴(kuò)增未知的靶片段。這一技術(shù)主要用在DNA測序、染色體步移技術(shù)(genome walking)和DNA指紋圖譜等。
7、Methylation-specific PCR (MSP):
甲基化特異性的PCR,用于研究基因組CpG島的甲基化模式。首先是用亞硫酸氫鈉處理靶DNA,使未甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化成尿嘧啶,尿嘧啶可被引物識(shí)別成胸腺嘧啶,然后分別用能區(qū)分修飾和非修飾模板的不同的引物來擴(kuò)增(一對可識(shí)別胞嘧啶引物擴(kuò)增原來甲基化的模板,令一對可識(shí)別尿嘧啶或胸腺嘧啶的引物擴(kuò)增非甲基化的模板)。結(jié)合定量PCR,可以對甲基化程度進(jìn)行定量。
8、Multiplex-PCR:
多重PCR,指在一個(gè)PCR管中使用多對引物同時(shí)擴(kuò)增超過一個(gè)的靶基因。同時(shí)分析單拷貝基因組的多個(gè)基因可避免分別擴(kuò)增這些靶基造成對試劑和模板的浪費(fèi)。使用多重PCR檢測引起遺傳疾病的基因突變時(shí),可以同時(shí)擴(kuò)增6個(gè)以上的靶點(diǎn),也可同時(shí)檢測食品中多種病原菌的存在。在多重PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA,多重連接探針擴(kuò)增技術(shù))使用單對引物即可完成對多個(gè)靶基因的擴(kuò)增,避免了多重PCR耗時(shí)的優(yōu)化步驟。
9、Nested PCR:
巢式PCR,通過使用兩套引物來進(jìn)行兩次連續(xù)的反應(yīng),用來增加DNA擴(kuò)增的特異性。在第一次反應(yīng)中產(chǎn)生的產(chǎn)物可能包含非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,然后使用兩個(gè)新的、結(jié)合位點(diǎn)位于原引物內(nèi)部的引物進(jìn)行第二次反應(yīng)。第二套引物的使用可提高反應(yīng)的特異性,增大單一產(chǎn)物產(chǎn)生的可能性。巢式PCR在提高特異性的同時(shí),也增加了檢測的靈敏度。
10、Quantitative PCR(Q-PCR):
定量PCR,用來測定樣本中的靶DNA的量。最初的定量PCR主要是指Competitive PCR(競爭定量PCR)。競爭定量PCR:在反應(yīng)混合物中加入起始拷貝數(shù)已知的內(nèi)部對照,對照具有同靶序列相同的引物結(jié)合位點(diǎn),但產(chǎn)生的產(chǎn)物長度與靶序列產(chǎn)生的產(chǎn)物長度不同,在PCR過程中對照與靶基因競爭相同的引物。反應(yīng)后通過比對對照和靶基因產(chǎn)生的產(chǎn)物量推斷初始靶基因的拷貝數(shù),由于內(nèi)部對照和靶基因在擴(kuò)增中的效率不一定相同,所以定量結(jié)果會(huì)產(chǎn)生偏差。
11、RT-PCR(Reverse Transcription PCR):
逆轉(zhuǎn)錄PCR,是用來擴(kuò)增、分離和鑒定細(xì)胞或組織的信使RNA(mRNA)的技術(shù)。反應(yīng)由兩個(gè)階段組成:
1、使用逆轉(zhuǎn)錄酶,通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)“RT”合成與RNA互補(bǔ)的cDNA(complementary DNA)
2、使用PCR擴(kuò)增特異性的cDNA。
由于PCR的預(yù)變性步驟可以用來失活逆轉(zhuǎn)錄酶,所以兩個(gè)階段可在同一管內(nèi)完成。一些DNA聚合酶如Tth也有RT活性,因此可以單獨(dú)使用這種酶來完成兩步反應(yīng)。
RT-PCR可廣泛用于表達(dá)圖譜分析(用來確定基因的表達(dá));鑒定RNA轉(zhuǎn)錄子的序列,當(dāng)相關(guān)的基因序列已知時(shí),還可進(jìn)一步知道基因組上外顯子和內(nèi)含子的位置;檢測病毒例如HIV、引起麻疹和腮腺炎的病毒。
12、Touch down PCR
降落PCR,是另一種簡單的降低非特異性擴(kuò)增的方法,可規(guī)避對PCR循環(huán)條件進(jìn)行耗時(shí)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。降落PCR過程中,首輪循環(huán)的退火溫度設(shè)置在比引物的解鏈溫度高出幾度,使每個(gè)后續(xù)循環(huán)的退火溫度逐漸降到,直到退火溫度降到等于引物的解鏈溫度或比引物的解鏈溫度低幾度,后續(xù)的循環(huán)在此較低的退火溫度下完成,整個(gè)程序的退火溫度可降低10-15℃。在最初幾個(gè)循環(huán)內(nèi),高溫使引物的非特異性結(jié)合難以發(fā)生,只有同引物互補(bǔ)程度最大的模板序列(很可能這一序列就是我們感興趣的序列)才能發(fā)生退火事件,因此保證靶序列得到優(yōu)先擴(kuò)增。后續(xù)循環(huán)降低退火溫度可保證擴(kuò)增效率,盡管最終的退火溫度降低到足以使非特異性產(chǎn)物有效擴(kuò)增的溫度,由于靶分子已經(jīng)開始指數(shù)期擴(kuò)增,因此抑制非特異性產(chǎn)物的進(jìn)一步形成。
13、Long PCR(Long distance PCR,Long range PCR)
長距離PCR,普通的Taq聚合酶一般只能擴(kuò)增不超過3-5kb的片段,通過使用特定的聚合酶和緩沖液成分,來擴(kuò)增較長的DNA鏈(10-40kb以上)。長距離PCR時(shí)經(jīng)常會(huì)在10-15個(gè)循環(huán)后,使每個(gè)循環(huán)的延伸時(shí)間都比上一循環(huán)的時(shí)間增加10秒左右,以補(bǔ)償聚合酶活性的損失。
14、Clony PCR
菌落PCR,通過PCR手段來迅速篩選陽性克隆子。使用滅菌的牙簽將菌落直接挑到反應(yīng)混合液中,通過PCR預(yù)變性步驟的高溫使細(xì)菌的基因組釋放作為PCR反應(yīng)的模板。菌落PCR中使用的引物定位在插入位點(diǎn)外側(cè)的載體區(qū),因此盡管插入的序列各不相同,也不影響擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。
15、RACE-PCR(rapid amplification of cDNA ends)
一種RT-PCR方法,當(dāng)對DNA序列信息了解較少時(shí),使用單個(gè)特異性引物加一個(gè)接頭引物來擴(kuò)增cDNA的5'端(對應(yīng)轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn))或3'端從而產(chǎn)生新的cDNA,重疊的RACE產(chǎn)物可結(jié)合起來產(chǎn)生全長的cDNA片段。
16、DD-PCR (differential display):
差異顯示技術(shù),用來鑒定不同組織中差異表達(dá)的基因。將不同組織的RT-PCR產(chǎn)物用短的、非特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,然后在凝膠上比對來源于不同組織的條帶,只在某種組織中才出現(xiàn)的條帶被認(rèn)為是差異表達(dá)的。
17、AFLP(Amplified fragment length polymorphism):
擴(kuò)增片段長度多態(tài)性,通過擴(kuò)增使不同生物基因組呈現(xiàn)不同長度的片段。
18、AP-PCR
(arbitrary primed)/RAPD (random amplified polymorphic DNA):
隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA,使用隨機(jī)寡核苷酸片段來擴(kuò)增序列未知的靶基因,形成基因組指紋圖譜,用來分析物種的相關(guān)性。
19、Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR:
可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列PCR,使引物定位在具有長度多態(tài)性的靶基因區(qū),通過在凝膠電泳后對產(chǎn)物的大小進(jìn)行分析來研究基因分型。
20、Inverse PCR:
反向PCR,允許擴(kuò)增已知序列側(cè)翼的DNA區(qū)。首先將靶DNA用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行多輪消化,然后連接被消化的片段構(gòu)建環(huán)狀的分子,引物設(shè)計(jì)成可從序列已知的區(qū)域向外側(cè)延伸,結(jié)果擴(kuò)增出環(huán)狀分子上剩余的序列。
21、Real-Time PCR:
實(shí)時(shí)PCR,由于通常的PCR在幾十個(gè)循環(huán)后都會(huì)進(jìn)入平臺(tái)期,產(chǎn)物的量與初始模板量不在成正比,因此只能用來定性。而實(shí)時(shí)PCR通過使用熒光染料,例如SYBR Green或熒光標(biāo)記探針,例如TaqMan可用來檢測隨著擴(kuò)增的進(jìn)行,產(chǎn)物量的變化而進(jìn)行定量。
22、原位PCR
原位雜交細(xì)胞定位和PCR的高靈敏度相結(jié)合的技術(shù),使得靶基因檢測有了極大的改進(jìn)。此技術(shù)是在細(xì)胞(爬片、甩片或涂片)或組織(石蠟、冰凍切片)上直接對靶基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,通過摻入標(biāo)記基團(tuán)直接顯色或結(jié)合原位雜交進(jìn)行檢測的方法。
23、PCR-SSCP
PCR-SSCP是1989年日本Orita等創(chuàng)建的篩查突變的技術(shù)。它是一種簡單、快速、經(jīng)濟(jì)的點(diǎn)突變篩查手段。PCR-SSCP技術(shù)的基本原理是PCR擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈DNA,單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)形成不同的立體構(gòu)象,其構(gòu)象直接影響泳動(dòng)速率,相同長度的 DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個(gè)堿基的差別,就可以產(chǎn)生立體構(gòu)象的不同,造成泳動(dòng)速率的不同,產(chǎn)生不同的泳動(dòng)帶。
PCR擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈后在不含有變性劑的中性膠中電泳,與正常比較出現(xiàn)泳動(dòng)帶的變位即可推測存在堿基置換。其堿基置換的性質(zhì)必須經(jīng)過DNA測序才能確定。因此PCR-SSCP檢測是測序之前突變篩查的常用手段。
為了便于觀察分析結(jié)果,PCR擴(kuò)增體系中常加入a-32P dNTP標(biāo)記PCR產(chǎn)物,電泳后放射自顯影觀察泳動(dòng)帶的位置。目前也常用銀染法來染色聚丙烯酰胺凝膠上的DNA泳動(dòng)帶,此方法可避免同位素的污染及對操作者的輻射損傷,但其靈敏度不如用同位素標(biāo)記。單鏈DNA片段的立體構(gòu)象主要與堿基序列相關(guān),但也受到其他條件的影響。
因此,PCR-SSCP技術(shù)的關(guān)鍵在于電泳時(shí)的諸多條件,如凝膠的組成、電泳的溫度、離子濃度以及影響分子內(nèi)相互作用的其他溶質(zhì)等。PCR-SSCP的缺點(diǎn)是存在假陰性和假陽性,一般對長度不超過300bp的待測片段的檢出率為70~80%。