維生素C是一種已糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以被人們稱做抗壞血酸，主要為還原型及脫氫型兩種，廣泛存在于植物組織中，新鮮的水果、蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、柿子葉、獼猴桃、柑橘等食品中含量較多。它是氧化還原酶之一，本身易被氧化，但在有些條件下又是一種抗氧化劑。

維生素C（還原型）純品為白色無臭結晶，熔點190～192℃，溶于水或乙醇中，不溶于油劑。在水溶液中易被氧化，在堿性條件下易分解，在弱酸條件中較穩(wěn)定，維生素C開始氧化為脫氫型抗壞血酸（有生理作用）。如果進一步水解則生成2，3-二酮古樂糖酸，失去生理作用。

根據(jù)它具有的還原性質可以測定維生素C的含量。常用的測定方法有

（1）2，6-二氯靛酚法  （還原型V_C）

（2）2，4-二硝基苯肼法  （總V_C）

（3）碘酸法

（4）碘量法

（5）熒光分光光度法

一、2，6-二氯靛酚滴定法

1、原理：

還原型抗壞血酸還原染料2，6-二氯靛酚，該染料在酸性中呈紅色，被還原后紅色消失。還原型

抗壞血酸還原2，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質干擾時，一定量的樣

品提取液還原標準2，6-二氯靛酚的量與樣品中所含維生素C的量成正比。

2、試劑

⑴ 1%草酸溶液：稱取10g草酸，加水至1000ml；

⑵ 2%草酸溶液：稱20g草酸，加水至1000ml；

⑶ 維生素C標準液：準確稱20mgV_C溶于1%草酸中，并稀釋至100ml，吸5ml于50ml容量瓶中，加入1%草酸至刻度，此溶液每毫升含有0.02mgV_C；

⑷ 0.02%2，6-二氯靛酚溶液：稱取2，6-二氯靛酚50mg，溶于200ml含有52mg碳酸氫鈉的熱水中，冷卻后，稀釋至250ml，過濾于棕色瓶中，貯存于冰箱內(nèi)，應用過程中每星期標定一次。

標定一：吸標液（V_C）5ml于三角瓶→加6%KI溶液0.5ml→加1%淀粉3滴→用0.001N KIO₃標液滴定到淡蘭色。

計算：

抗壞血酸濃度（mg/ml）= （V₁ × 0.088）/ V₂

V₁ - 滴定時消耗0.001N KIO₃標液的體積（ml）

V₂ -維生素C重量（g）

0.088 -1ml0.001N KIO₃標液≈維生素C的量（mg/ml）

標定二：吸5ml已知濃度V _C標液 → 加5ml1%草酸 → 用染料2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉紅色，在15秒不褪色為終點

計算：每毫升2，6-二氯靛酚相當于維生素C的毫克數(shù)等于滴定度（T）

T= （C × V₁）/  V₂

C - 維生素C的濃度（mg/ml）

V₁ -維生素C的體積（ml）

V₂ -消耗2，6-二氯靛酚的體積（ml）

⑸ 0.001N KIO₃標液：吸0.1N KIO₃溶液5ml→于500ml容量瓶內(nèi)→加水至刻度，每毫升相當于V_C0.008mg；

⑹ 0.5%淀粉溶液；

⑺ 6%KI溶液；

3、操作方法

⑴ 提取：稱樣50g→加2%草酸100ml→到入搗碎機中→處理→過濾→顏色若深可加白陶土

⑵ 滴定：吸5ml樣液→于三角瓶→用染料滴定至粉紅色→15秒內(nèi)不褪色

計算：

V_C（mg/100g）=（V × T）/ W   × 100

V -消耗染料體積（ml）

T -1ml染料所能氧化維生素C的毫克數(shù)

W- 滴定時所有濾液中含有樣品的克數(shù)

4、注意事項

⑴ 所有試劑的配制最好都用重蒸餾水；

⑵ 滴定時，可同時吸二個樣品。一個滴定，另一個作為觀察顏色變化的參考；

⑶ 樣品進入實驗室后，應浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，損失維生素C；

⑷ 貯存過久的罐頭食品，可能含有大量的低鐵離子（Fe²⁺），要用8%的醋酸代替2%草酸。這時如用草酸，低鐵離子可以還原2，6-二氯靛酚，使測定數(shù)字增高，使用醋酸可以避免這種情況的發(fā)生；

⑸ 整個操作過程中要迅速，避免還原型抗壞血酸被氧化；

⑹ 在處理各種樣品時，如遇有泡沫產(chǎn)生，可加入數(shù)滴辛醇消除；

⑺ 測定樣液時，需做空白對照，樣液滴定體積扣除空白體積。

二、2，4-二硝基苯肼法

可測總抗壞血酸，總抗壞血酸包括還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸型。此法是將樣品的還原型抗壞血酸氧化為脫氫型抗壞血酸，然后與2，4-二硝基苯肼作用，生成紅色的脎。脎的量與總抗壞血酸含量成正比，將紅色脎溶于硫酸后進行比色，由標準曲線計算樣品中總V_C。

1、原理：

用酸處理過的活性碳把還原型的抗壞血酸氧化為脫氫型抗壞血酸，在繼續(xù)氧化為二酮古樂糖酸。

二酮古樂糖酸與2，4-二硝基苯肼偶聯(lián)生成紅色的脎，其成色的強度與二酮古樂糖酸濃度呈正

比，可以比色定量。

2、步驟

⑴ 樣品處理與分析

稱一定樣 → 加等量2%草酸 → 于高速搗碎機搗碎 → 取勻漿20g → 用1%草酸定容100ml → 過濾 → 取濾液10ml → 加1%草酸10ml → 加少量活性炭 → 搖1分鐘 → 靜置過濾 → 各取濾液2ml于樣品管和樣品空白管 → 各管加入1滴硫脲溶液 → 于樣品管中加入2，4-二硝基苯肼0.5ml → 分別于兩個管加蓋 → 于37℃保溫箱3小時 → 取出后樣品管放入冰水中 → 樣品空白管取出后冷至室溫 → 在樣品空白管加入2，4-二硝基苯肼 → 0.5ml → 樣品管和空白管都于冰浴中 → 滴加85%H₂SO₄2ml于各管中 → 邊滴邊搖 → 防止溫度升高炭化后呈黑色 → 冰浴中30分鐘后取出 → 室溫下放置30分鐘后，在540nm測消光值，從標準曲線上查出相應的含量

⑵ 標準曲線的繪制

取5個50ml容量瓶編號  1     2     3     4     5

加V_C標液0.2mg/ml     10    20    30    40    50ml

取5個比色管取相應     2     2     2     2     2

加硫脲溶液（滴）       1     1     1     1     1

2，4-二硝基苯肼（ml）0.5   0.5    0.5   0.5    0.5     

于37℃保溫箱3～4小時，取出于冰浴中，然后滴加85%硫酸2.5ml→取出放30分鐘→在540nm下測各消光值繪標準曲線，同時做空白。

計算：每百克食品中抗壞血酸的毫克數(shù)=C/W *100