近日,蒙牛純牛奶被檢測(cè)出強(qiáng)致癌物——黃曲霉毒素M1,消息一出頓時(shí)又掀起一股食品安全隱患的討論。相比之前的三聚氰胺,黃曲霉素是否更難檢測(cè)?
現(xiàn)整理出全套的專業(yè)檢測(cè)方案,讓乳和乳制品中黃曲霉毒素M1無處躲藏。
1. 試用范圍
牛奶,奶粉,發(fā)酵乳,干酪,奶油等乳制品
2. 方法原理
黃曲霉毒素M1易溶于極性溶劑,因此均勻基質(zhì)中的黃曲霉毒素M1可以通過甲醇/水震蕩分散提取,對(duì)于高脂肪/油含量的樣品基質(zhì)加入正己烷予以脫脂。本方法采用免疫親和柱凈化,熒光檢測(cè)器測(cè)定乳制品中黃曲霉毒素M1。
3. 所需設(shè)備和耗材
黃曲霉毒素免疫親和柱:Welchrom? IAC (1ml,25支/盒;3ml,15支/盒)(上海月旭提供);
高效液相裝置帶熒光檢測(cè)器;
均質(zhì)機(jī);
水平振蕩器;
SPE轉(zhuǎn)接頭及50ml大容量上樣器:Welchrom? SPE Adapter(上海月旭提供);
分析天平(精度0.02 g);
SPE裝置帶抽真空系統(tǒng):Welchrom? SPE Device(上海月旭提供);
黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品;
PBS 緩沖溶液:稱取1.16 g Na2HPO4,0.20 g KH2 PO4,8 g NaCl和0.2 g KCl 溶于900ml水中,用HCL或NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4,然后定容至1000ml;
甲醇(色譜純);
乙腈(色譜純);
正己烷(分析純)。
4. 樣品前處理
牛奶樣品
1. 稱取25g(精確至0.01 g)混勻的樣品,置于50 mL具塞離心管中,水浴加熱至35℃~37 ℃,6000 r/min下離心10 min。收集全部上清液,待凈化;
2. 發(fā)酵乳(包括固體狀、半固體狀和帶果肉型)
3. 稱取25 g(精確至0.01 g)混勻的樣品,用0.5mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4,9500r/min下均質(zhì)5 min,水浴加熱至35℃~37 ℃,6000 r/min下離心10 min。收集全部上清液,待凈化。
4. 乳粉和粉狀嬰幼兒配方乳制品
5. 稱取10 g(精確至0.01 g)樣品置于250 mL燒杯中,加入50 mL約50 ℃的水于乳粉中,玻璃棒攪拌均勻。溶解后冷卻至室溫,移入100 mL容量瓶中,水洗燒杯并轉(zhuǎn)移洗滌液,用PBS定容至刻度后裝入離心管6000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15 min,混合上清液,取50mL上清液待凈化。
干酪
切取均質(zhì)的樣品5g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加2 mL水和30 mL甲醇,9500 r/min下勻漿5 min,超聲提取30 min,6000r/min下離心10 min。收集上清液并移入250 mL分液漏斗中,同時(shí)加入30 mL正己烷,振搖2 min,分層后,棄去正己烷層。重復(fù)用正己烷提取2次。提取液減壓濃縮至約2 mL,轉(zhuǎn)移濃縮液至離心管,燒瓶用甲醇-水溶液(1+4)5 mL分2次洗滌并倒入50 mL離心管中,加PBS溶液稀釋至50 mL,6000r/min下離心5 min,上清液待凈化。
奶油
稱取5g(精確至0.01 g)試樣,置于50 mL燒杯中,用20 mL正己烷將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中。加20 mL水和30 mL甲醇,振蕩30 min后,將全部液體移于分液漏斗中,待分層后,將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至約5 mL,加PBS稀釋至約50mL,待凈化。
5. 免疫親和柱凈化(3cc)
1. 將IAC裝于固相萃取裝置上,接上大體積上樣器,10ml PBS溶液活化柱子,流速保持在2–3 ml/min,確保上樣前柱子保留少量(0.5ml)的PBS溶液,活化液不收集;
2. 將待凈化液加入免疫親和柱,流速不超過5 mL/min,不收集流出液;
3. 用約20ml去離子水淋洗柱子,流速不超過5 mL/min,抽真空1分鐘,不收集流出液;
4. 用1.5ml甲醇洗脫,流速控制在1d/s,收集洗脫液過膜后上機(jī)測(cè)試。
注:免疫親和柱從冰箱去除需升到室溫后使用
6. 色譜條件:
色譜柱: Ultimate? XB-C18 250 mm x 4.6 mm,5μm(上海月旭提供)
預(yù)柱: Ultimate? C18,5μm,ULT5BG18(上海月旭提供)
流動(dòng)相: 水:甲醇:乙腈=11:4:5
柱溫: 35℃
檢測(cè)波長: 發(fā)射波長:365nm,激發(fā)波長:450nm
進(jìn)樣量: 100μL