引言

當比較HPLC和SFC的多項應用時，有人發(fā)現(xiàn)SFC因超臨界液體的低粘滯度和高擴散率而能提供更好的選擇性和更短的分析時間。

SFC用于制備模式時可顯著降低成本，這是因為餾份通常收集在較小體積的揮發(fā)性醇中而由此減少了相當多的純化后續(xù)工作。乙腈（ACN）的持續(xù)短缺也促使多個行業(yè)對SFC在分析和純化方面能否替代乙腈依賴性反相液相色譜（RPLC）進行評價�，F(xiàn)在，科學家在探尋、企業(yè)也在開發(fā)更多適用于SFC的包括UV、FID、MS和ELSD在內(nèi)的檢測器。

蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）最初為高效液相色譜（HPLC）進行基于質(zhì)量的非揮發(fā)性化合物檢測而設計1。因為這種檢測機制不依賴于化合物的光學屬性，所以ELSD被認為是一種通用檢測器，特別適用于檢測不存在紫外光發(fā)色團的分析物。很多制藥實驗室和化學實驗室將ELSD與紫外檢測和質(zhì)譜（MS）同時使用，以確保用于對組成各異或比較復雜的混合化合物進行色譜分析的通用檢測的“真實性”。ELSD也被發(fā)現(xiàn)可廣泛用于包括膳食補充劑、運動營養(yǎng)品、維生素、有機食品、飲料、化妝品和美容產(chǎn)品在內(nèi)的天然產(chǎn)品的分析和純化。

我們曾報告過使用SFC ELSD分析運動飲料中甜味劑的個案研究2以及對SFC ELSD試驗參數(shù)所進行的詳細評價3，這兩項研究均采用分析規(guī)模。我們在此呈現(xiàn)關于ELSD用于小規(guī)模制備型SFC的可行性研究。我們希望此處所述的結(jié)果能促進專業(yè)人員將ELSD并入涉及分析和制備規(guī)模SFC的日常工作流程中。

試驗

材料

酮洛芬和對乙酰氨基酚購自西格瑪奧德里奇公司（美國密蘇里州圣路易斯市）。將酮洛芬和對乙酰氨基酚溶解于HPLC級甲醇中，制得用于分析試驗的0.5 mg/mL儲備液和用于純化的5 mg/mL儲備液。硅膠柱（分析型：4.6 x 250 mm，填充5 μm顆粒；制備型：10 x 250 mm，填充6 μm顆粒）購自普林斯頓色譜儀器公司（美國新澤西州普林斯頓）。

色譜分析

各項試驗均使用配備沃特世2998型光電二極管陣列（PDA）檢測器和沃特世ELSD（美國馬薩諸塞州米爾福德）的一臺SFC Investigator II儀器（沃特世子公司T harSFC，美國賓夕法尼亞州匹茲堡）進行。

ELSD信號（模擬信號輸出）通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器傳輸?shù)絊uperChrom軟件。一個10 μL的定量環(huán)用于各次分析型進樣，而一個200 μL的定量環(huán)則用于各次制備型進樣。ELSD使用一根內(nèi)徑0.010英寸的不銹鋼三通和25 μ x50 cm的PeekSil管在PDA和反壓調(diào)節(jié)器之間分流出來。分析型方法在流速為4 mL/分鐘（85:15 CO2/甲醇）、反壓為150巴和溫度為40?C的條件下運行。分析型方法的ELSD條件設置如下：增益=1000、噴霧器溫度= 45?C、管道溫度= 45?C、壓力= 30 psi。制備型方法在流速為10 mL/分鐘（80:20 CO2/甲醇）、反壓為150巴和溫度為40?C的條件下運行。ELSD條件設置如下：增益=1000、噴霧器溫度= 28 ?C、管道溫度= 50 ?C、壓力= 60 psi。收集裝置上的補償泵被設置為每分鐘用泵抽吸2 mL甲醇。對于純化應用，以200μL的進樣量連續(xù)進樣五次，或者說每種化合物進樣1 mg（兩種化合物共2 mg），那么每種化合物的進樣總量為5mg（兩種化合物共10 mg）。

結(jié)果和討論

圖1顯示了使用ELSD和UV得出的酮洛芬/對乙酰氨基酚混合物的分析型SFC色譜圖。ELSD和UV信號之間略微存

在時間滯后（約2秒）。由于ELSD信號用于餾份觸發(fā)，因此滯后時間對制備型色譜特別重要。應充分注意確保信

號處理時間與流出液達到收集閥的時間保持一致，或者需要進行適當?shù)挠嫊r補償，以盡可能減少收集過程中的

損失。例如，在我們的試驗中使用了一根25 μ × 50 cm的PeekSil管，以將主流量分流到ELSD中。首選小內(nèi)徑管，

以盡可能減少進入ELSD的流量，實現(xiàn)樣本損失量的最小化。然而，管長由UV和ELSD信號之間的時間滯后而決

定。較長的管子將因抗性增強而進一步減少流入ELSD的樣本量；然而，這也將增加兩種信號之間的時間滯后。

在本例中，2秒的時間滯后小于總峰寬的3%。

其次，我們優(yōu)化了制備型進樣的ELSD設置，結(jié)果如圖2所示。從分析型到制備型設置出現(xiàn)了兩個改變：流速從4 mL/分鐘提高到10 mL/分鐘，改性劑百分比從15%增加20%；這兩種改變將導致流入ELSD的液體增多。在我們的前一項研究3中，對氣體流速和蒸發(fā)溫度的作用進行了描述。簡言之，氣體流速越高，停留時間就越短，出現(xiàn)散射的次數(shù)也越少，進而信號越差。氣體流速越高，噴霧過程中所形成的小顆粒就越多。粒徑的減小也導致散射光的強度降低。此外，也建議將蒸發(fā)溫度維持在盡可能低的水平下，以保持粒徑的一致性，并通過增強溶解結(jié)晶作用而獲得更好的信號。這一點與圖2所示的結(jié)果吻合：增加氣體流速和降低蒸發(fā)溫度似乎可產(chǎn)生帶有更少“尖峰”的更窄色譜峰。注意制備型進樣的樣本濃度要高得多；靈敏度不再是主要關注點。恰恰相反，優(yōu)化目標在于產(chǎn)生可靠且重現(xiàn)性好的信號。有代表性的制備型SFC色譜圖見圖3。圖3(b)顯示了疊加進樣的SFC色譜圖。循環(huán)時間通過進行疊加進樣而更為縮短，進一步提高了產(chǎn)能�；厥章屎图兌韧ㄟ^再次進樣所收集的餾份并將由此得到的峰面積與預先繪制的校準曲線進行比較而確定。在本研究中，酮洛芬和對乙酰氨基酚的回收率分別為88%和84%，純度分別為98%和100%。





 

結(jié)論
 

在本研究中，我們證實了使用ELSD可觸發(fā)小規(guī)模制備型SFC的餾份收集。本研究所用標準品的回收率大于84%，純度大于98%。儀器配置和ELSD優(yōu)化方面的根本原則應該同樣適用于大規(guī)模制備型SFC。